Fig.3 Construction of recombinant transfer vector pCAE1A and recombinant virus v5Ad4

E: EcoRI, B:BamHI, 1.3 kb open reading frame of E1A gene digested from pCMVE1A was inserted into EcoRI/BamHI site of vector pCA13, which resulted into recombinant transfer vector pCAE1A. 293 cells were cotransfected with pCAE1A and pBHG11, homologous recombination between pCAE1A and pBHG11 in 293 cells resulted into recombinant virus v5Ad4.

　　2.2　重组病毒v5Ad4的构建与病毒颗粒的包装　质粒pBHG11由于腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp（0.5～3.7 mu）缺失，一个氨卞抗性基因（Apr）和一个细菌的复制起始位点（Ori）取代了该区域，即同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦缺失。pBHG11必须与左臂带有腺病毒包装信号序列的穿梭载体共转染，才能产生有感染性的重组载体。质粒pCAE1A含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp（0～16.1 mu）核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp（1.0～9.8 mu）的序列缺失；E1区内有一个置于HCMV IE启动子（-299～+72 bp）控制下的多克隆位点中的E1A表达盒，并有SV40 poly（A）信号。pBHG11-Apr-ori-的左臂为腺病毒5型基因组0～188 bp，其右臂为腺病毒5型基因组1 337～27 865 bp，pCAE1A中E1A表达盒左臂为腺病毒5型基因组22～342 bp，右臂为腺病毒5型基因组3 523～5 790 bp。两者的左右臂具有足够的同源区域，可以在共转染的293细胞内发生同源重组。由于pBHG11无Ψ因子，pCAE1A虽然有Ψ因子，但仅有极短的腺病毒5型基因组序列，所以pBHG11不能被包装，pCAE1A不能形成病毒粒子，只有带Ψ因子和大部分腺病毒5型基因组的重组病毒才可能被包装。重组病毒v5Ad4的构建如图3所示。

　　经pCAE1A和pBHG11共转染的293细胞6 d后开始变圆肿胀，部分裂解死亡，有明显CPE症状。透射电镜观察，在共转染7 d后的293细胞上清可见球状（二十面体）病毒粒子（图2），命名为v5Ad4。

　2.3　重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞的影响　v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，19 h后80%细胞变圆悬浮，有明显CPE症状，5%裂解，3 d后，*细胞变圆悬浮，60%裂解（图4A）。而经等量v5Ad4感染的正常人胚肺细胞中，3 d至两周，存活细胞比率一直保持*（图4B），表现了对v5Ad4诱导的细胞裂解的高度抗性。

图4A　重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞A549的感染

Fig.4A The infection of recombinant virus v5Ad4 in human tumor cell line A549

　　（a） A549 cell without the infection of v5Ad4 or wide type adenovirus （200×） （b） A549 cell with the infection of v5Ad4 （400×） （c） A549 cell with the infection of wt-Ad （400×）