蛋白质280nm/254nm双波长测定：

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定性、定量测定的依据，正因为如此，280nm处的紫外吸收法通常被用于层析系统中蛋白质浓度的连续监控。但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少非蛋白物质在280nm波长下也有-定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸（嘌呤和嘧啶碱）的影响更为严重。在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在254nm处的吸收更强，其吸收高峰在254nm附近。核酸254nm处的消光系数是280nm处的2倍，

而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于254nm的吸收值。

通常：

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A254》1.8

纯核酸的光吸收比值：A280/A254《0.5

因此蛋白质溶液中同时存在核酸时（生物体系大多数如此），必须同时测定OD254nm，与OD280nm。然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A254（mg/ml）

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。