AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒

产品简介：
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所*的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是 完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用Annexin V与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤:
1、细胞样品的准备：
a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，细胞可以被轻轻
用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次
收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法*离心离心管底，
可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约 1ml 4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法*离心离心
管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免
吸走细胞。加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
2、用去离子水按 1:3 稀释结合缓冲液(4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水)；
3、用 1x 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5×106/ml；
4、取 100µl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混匀后于室温避光孵育 5 分钟；
5、加入 10µl 20ug/ml 的碘化丙锭溶液(PI)，并加 400µl PBS，立刻进行流式检测。
实验设计：
1、空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压；
2、单染管：阳性对照组细胞，只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于调节补偿；
3、检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿
后，获得所需要的流式数据。
注意事项：
1、Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂
质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧；
2、低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2～3 次，离心机 4℃1000rpm 5min 离心，处理得当的话，胰酶造成损
伤可以控制在 5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3、先加PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI 本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰
酶大，不建议这样做；
4、Annexin V 是Ca 依赖的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V，进而影
响结果。
5、用流式检测凋亡时，PI 受时间的影响很大，因标记了 PI 后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致 PI 的染
色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显
加大。一般 PI 加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成
的误差会更小。

相关文献：

《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影响因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影响因子:2.705 PMID:30446227
 

AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒