大鼠肿瘤坏死因子αTNF-α酶联免疫试剂盒

检测原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗大鼠TNF-α单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的大鼠TNF-α会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗大鼠TNF-α抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的大鼠TNF-α发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的大鼠TNF-α，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的大鼠TNF-α浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中大鼠TNF-α的浓度。

原理图：

注意事项：※※※

• 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
• 试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
• 试剂盒使用前请在室温恢复30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
• 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持*。
• 为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.
• 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 

盖上，使用前请离心处理（5-10 S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。

• 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试

剂代替本试剂盒中的某单个组分。

• 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。

安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

试剂盒组成及储存：

自备实验器材（不提供，可代购）

• 酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）
• 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
• 洗板机或洗瓶
• 37℃孵育箱
• 双蒸水，去离子水，量筒等
• 稀释用聚丙烯试管

样本收集及储存：

• 细胞培养上清：

将细胞培养基移无菌离心管，在4℃条件下1000 g（3000 rpm）离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

• 血清样本：

室温血液自然凝固20 min后，在4℃条件下1000 g（3000 rpm）离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。

• 血浆样本：

将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20 min，在4℃条件下1000 g（3000 rpm）离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

试剂准备：

• 试剂回温：先在实验前30 min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
• 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。

3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml冻干标准品中，静置15分钟待其*溶解后轻轻混匀(浓度为4000pg/ml)，然后按照以下浓度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（1000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

生物素化抗体工作液具体稀释方法如下：

5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

酶结合物工作液具体稀释方法如下：

6. 洗涤方法：

• 自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注

与吸出间隔为30秒，洗板5次。

• 手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

检测步骤：

结果判断：

1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。

2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值

3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNF-α含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。

参数表征：

1. 数据及标准曲线

本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算大鼠TNF-α的样本含量

2. 灵敏度：

低可检测大鼠TNF-α浓度达15pg/ml，

20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。

3. 特异性：

不与人TNF-α、TNF-β反应，猪TNF-α，小鼠TNF-α等反应

4. 重复性：

板内，板间变异系数<10%

5. 回收率：

健康大鼠血清、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的大鼠 TNF-α，计算回收率。

6. 线性稀释：

分别选取4 份健康大鼠血清和细胞培养上清加入高浓度大鼠 TNF-α，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。

参考文献：

1. Aggarwal, B.B. (2003) Nat Rev Immunol 3, 745-56.

2. Hehlgans, T. and Pfeffer, K. (2005) Immunology 115, 1-20.

3. Lin, P.L. et al. (2007) J Investig Dermatol Symp Proc 12, 22-5.

4. Brennan, F.M. and McInnes, I.B. (2008) J Clin Invest 118, 3537-45.

5. Pennica, D. et al. (1984) Nature 312:724.

6. Wang, A.M. et al. (1985) Science 228:149.

7. Moss, M.L. et al. (1997) Nature 385:733.

8. Wang, C.Y. et al. (1998) Science 281:1680.

常见问题及解决方法：

大鼠肿瘤坏死因子αTNF-α酶联免疫试剂盒订购说明：

1、绝大部分产品备有现货，一般情况下都能订货当日发货。 
2、部分非常用产品，需提前1－2日预订，海外期货则需要提前3-6周预订。 
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化，若有变动以订货当日新价格为准。 
4、每日订单截止时间为16点整，部分城市可到17点整，因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后，将底单等连同收货人的地址、姓名、等以传真、、短信、等形式通知我们。

大鼠肿瘤坏死因子αTNF-α酶联免疫试剂盒运输说明：

极低温产品：极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来，再用泡沫盒密封，胶带层层粘住泡沫盒，放入索莱宝的箱子，然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。
低温产品：低温产品运输过程中加装索莱宝冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来，再使用泡沫盒密封，用胶带严实密封泡沫盒，再放入索莱宝的箱子（保温效果少可以持续一周），然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。
常温产品：常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货，准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。