森林脑炎IgM检测试剂盒（ELISA）说明书

【预期用途】

本试剂盒可用于定量检测人血清血浆和脑脊髓液中的抗脑炎病毒（TEBV）的IgG抗体，从而控制体液免疫状态和确定疫苗接种后的血清转化。鉴别明显的和潜在的脑炎病毒的感染，通常附带着抗脑炎病毒的IgM的检测。

【临床背景】

在欧洲，森林脑炎和莱姆病是zui为常见的蜱媒传染病。莱姆病分布非常广泛，但森林脑炎只存在于一些特殊的地方（德国南部、图林根州、奥地利、瑞士、匈牙利、瑞典、捷克、斯洛伐克共和国、克罗地亚、斯洛文尼亚以及一些前苏联地区等。）。

这两种病的感染都跟它们的发育类似，包含两个或两个以上的阶段。森林脑炎的病毒血症阶段含有3~14天的孵育阶段，在此阶段的初期（1-8天） 会出现类似流行性感冒的症状。在大概一周没发热的间隔后，感染进入第二阶段，以神经系统方面的症状强度的改变为特征，这种阶段可能持续几周时间。

在疾病第二阶段的初期，通常可以检测到抗森林脑炎的IgM抗体。抗体水平在2~6周后达到峰值。抗体水平要降低到可检测以下可能需要10个月时 间。抗森林脑炎的IgG抗体在IgM抗体出现的同时或者之后几天内即可检测到。感染意味着出现通常能维持一生的免疫力。接种疫苗也能预防疾病。

脑脊髓液中的森林脑炎特异性抗体可能是在对森林脑炎抗原进行免疫应答时或者之前由血脑屏障的功能紊乱引起的，又或者是局部的免疫应答引起的。所以，脑脊髓液中抗体水平的波动可能跟这些一般在血清或血浆中的抗体水平不一样。

由于添加了RF/IgG吸附剂所以RF因子和特异性IgG不会干涉IgM的检测。这两种检测系统的结合可以用于森林脑炎疫苗接种后的体液免疫随访或者感染，早期的森林脑炎感染和监测人血清、血浆和脑脊髓液中的抗体水平。

【检测原理】

本试剂盒使用的是两步法ELISA。微孔中包被了失活的森林脑炎病毒。稀释后的血清、血浆或者脑脊髓液样本在微孔中孵育。孵育期间，森林脑炎特 异性抗体会跟森林脑炎病毒相集合，未结合的部分通过洗板洗去。加入酶联物进行孵育，HRP标记的抗人IgG抗体会跟人IgG抗体特异性结合。加入底物液后 颜色转变成蓝色，孵育一段时间后加入终止液终止反应，颜色从蓝色转换成黄色，zui后在酶标仪上读数。

【储存和稳定性】

此试剂盒在室温发货，储存在2 – 8℃。避免高温或太阳光直射。样本和准备好的试剂的储存和稳定性在相应的章节都有阐明。包被板条在有效期内都能保持稳定，储存在2 – 8℃下时应和干燥剂一起密封在小袋中。

【样本采集和储存】

血清、血浆或者脑脊髓液

【试剂组成】

【试验需要但试剂盒不提供的设备】

1.         一次性使用的5;25;50;100;500μl加样枪头

2.         漩涡混匀器

3.         样品稀释管

4.         轨道振荡器（200-900rpm）

5.         8道微量移液器和加样槽。

6.         洗瓶，自动化或半自动化的洗板机

7.         450nm的酶标仪

8.         双蒸水或去离子水

9.         纸巾，移液管，计时器

【实验前准备】

1.       浓缩试剂的准备（用于32孔的例子）

2.       标准品、质控品和样本的稀释

用于标准曲线方法需要1~5校准品和指控血清；样本所含的浓度如果高于zui高校准品浓度需要进一步稀释。用于一点标定法则只需要校准品4和质控血清即可。

【实验步骤】

1.       将200μL已稀释的校准品、质控品和样本加到相应的微孔中。

2.       用封板片封板，室温下（18-25℃）孵育1小时

3.       揭去封板片，弃去反应液，用稀释后的洗涤液洗板3次（250μL/孔/次），zui后通过拍板拍去残留的液体

4.       将200μL已稀释的酶联物加到每个孔中

5.       用封板片封板，在室温下（18-25℃）孵育1小时

6.       重复步骤3

7.       将200μL  TMB底物液加到每个孔中

8.       室温（18-25℃）孵育30分钟

9.       按加TMB底物液的顺序，将50μL的终止液加到每个孔中，轻轻混匀

10.   在加入终止液后10分钟内，用酶标仪在450nm±10nm处读数。

【结果的计算】

1.       标准曲线方法

在半对数纸上（或者使用自动化仪器）以每个标准品的OD值为Y轴，相应的浓度为X轴做出标准曲线，推荐使用4参数逻辑函数（Y=d+（a-b）/（1+（x/c）^b））。

样本的浓度应当直接从标准曲线中读取，如果有稀释，则在计算中应该乘以稀释倍数，如果样本的浓度过高，则需要按照实验前设置说明稀释样本。

2.       一点标定法

（1）       样本浓度的手册检测

需要使用用校准品4、质控血清和样本各自的平均OD值。校准品4的OD必须要在的范围内（见一点标定法评估表）。每次检测都必须计算检测特殊的校正因子。校准品4的理论OD值都是按特定批次检测得出的（见一点标定法评估表）。将质控血清和样本的OD乘以校正因子：

质控血清和样本浓度可以从批次参考曲线中读出。

例子：

校准品4的理论OD值                  OD=1.377

校准品4的检测OD值                  OD=1.273

校正因子F                             F=1.082

样本的检测OD值                      OD=0.937

样本的校正OD值                      OD=1.014

读取浓度                         0.5VIEU/mL

（2）       脑脊髓液样本浓度的计算（一点标定法软件）

打开名为“One Point Calibration TBE IgG Liquor”的Excel文件，将QC证书的下列指标填到Excel中：

校准品4的理论OD值

校准品4的OD范围

临界1和临界2的理论OD值

临界1 OD=灰区的zui低点

临界2 OD=灰区的zui高点

填入检测到的校准品4平均OD，将脑脊髓液样本的鉴别和OD插入到已准备好的计算单中。脑脊髓液样本的求值和OD都会自动完成。

【结果的判定】

血清/血浆

＜63VIEU/mL         阴性

63-126VIEU/mL       灰区

＞126VIEU/mL        阳性

脑脊髓液

OD＜临界1理论OD                      阴性

临界1理论OD＜OD＜临界2理论OD       灰区

OD＞临界2理论OD                      阳性

【结果的说明】

1.       疫苗

通过检测血清血浆中的抗TBE的IgG抗体来证明血清转化

（1）       抗TBE IgG阴性

接种疫苗后无血清转化

（2）       抗TBE IgG 灰区

可能有血清转化，建议在2~4周内再次检测

（3）       抗TBE IgG阳性

接种疫苗后有血清转化

2.       感染

（1）       抗TBE IgM和抗TBE IgG 阴性    

无感染

（2）       抗TBE IgM阴性和TBE IgG 阳性  

这可能是潜在的免疫或者是几周或几月之前的感染

（3）       抗TBE IgM阳性和TBE IgG阴性

可能有新近感染

（4）       抗TBE IgM和抗TBE IgG都阳性

有感染

本译文由广州健仑生物科技有限公司技术人员编译，仅供参考，详情请与我们。

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