1.样本类型和采集：

血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置0.5-2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

细胞裂解液: 吸弃培养液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞，加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。悬浮细胞可省略。收集细胞悬液，4℃ 1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。加入适量的预冷PBS或非变性细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞,通常6孔板一个孔的细胞量需要150-250μL PBS重悬。 将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融3次，使细胞充分裂解,也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。4℃ 10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下，可以储存72h，在- 20℃或-80℃可以储存6个月及以上。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融。

步骤：

1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）。

2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10-20分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意：

1. 试剂准备：试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用。准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。

2. 加样：实验操作中请使用一次性的灭菌吸头，避免污染。加样时注意不要有气泡产生，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样，加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔尽量小（一般控制在10 分钟以内），如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。为了测值的准确性，推荐设置复孔进行实验。

3. 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4. 洗涤：浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。充分洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水，同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机，请在熟练使用后再用于正式实验过程中。

5. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如观察到颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。

6. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。