3D多能干细胞：更简单的培养、更仿真的分化技术

引言

制备拟胚体

多能性验证

大限度提高分化效率

结论

材料

参考文献

引言

本书论述了在多能干细胞（PSC）来源的胚胎发育与分化的生产过程中进行三维（3D）细胞培养的重要性。本文包含了拟胚体（EB）技术的概述，并就生成拟胚体的不同技术进行了比较。同时，也针对验证新建立PSC细胞系多能性的应用，对畸胎瘤分析与EB技术进行了比较和讨论。后，本文还对近通过3D培养来提升分化效率的文献进行了一个简短的描述。

制备拟胚体

拟胚体（EB）是PSC的三维聚集物，可以重现胚胎的结构，这也意味着其中包含了完整的三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层）。EB分化的初始阶段与植入后早期胚胎的分化过程极其相似¹。EB当中先分化的细胞类型为原始内胚层的外层，这也是分泌出基底膜的一层细胞。

分泌出来的胞外基质包裹着内部的原始外胚层细胞，相当于胚胎的外胚层。未与基底膜接触的原始外胚层细胞会发生凋亡现象，进而形成一个囊状结构。在胚胎中，胚外信号中心在外胚层形成了一个精确的原条位点（这也是原肠的起始位点），进而形成中胚层与内胚层。然而， EB缺少胚外信号中心，因此相比胚胎而言，EB原始外胚层向中胚层与内胚层的分化过程显得混乱和缺乏组织性。两个研究组提出，EB比之前的猜想更有组织性；如果在正确的时间给予正确的信号，它们的组织性会得到极大提升，进而形成与正常胚胎发育十分相近的过程，其中也包括了原肠胚的形成过程^{2, 3}。这些特性使得EB成为了一个*的模式系统，通过这一系统，可在一个原来难以介入的时间点研究各类胚胎发育过程，特别在人源细胞研究中尤其重要。^{4, 5}.

目前可通过多种方法来制备EB，部分方法如图1所示。这些方法重要的特点是能够抑制PSC的表面贴壁效应，促使它们通过依赖E-钙粘着蛋白的粘附通路相互粘连起来。

图1 部分制备拟胚体的方法。图片源自⁶。

培养皿（静止）、旋转瓶和低转速培养容器等悬浮培养装置易于设置和维护，但会形成不同大小的EB，并聚集成各类形状的团块（图2）。EB大小增加会降低质量传输速率⁷。不仅如此，业界普遍认为EB大小和形状的改变还会改变分化模式⁸。此外，一旦原始内胚层开始分泌胞外基质，EB就将开始随机贴壁（即使是培养皿的疏水表面），这会导致贴壁与悬浮EB的细胞系出现巨大的特性差异。使用旋转瓶与低转速培养容器可减少聚集现象，并避免之前所提到的贴壁现象，不过使用这类培养容器需要在悬浮与剪切力造成的细胞损伤之间找到平衡点⁹。强制聚集培养技术 - 使用圆底低粘附平板、离心管和工程改造的微孔培养皿（图1中未展示）等容器 - 用户可通过测定每孔中加入的细胞数目，精确控制EB的大小。

图2 培养于低转速培养容器（A），悬滴培养（B）和在细菌培养皿中静态悬浮培养（C）的EB图片。请注意悬滴培养的EB在尺寸与形状上都获得了的均一度。图片源自⁹。比例标尺 = 500 μM

在微孔和试管中强制聚集培养的缺点之一是，通过刚性的人造塑料界面人为地决定和限制了EB的形状，进而可能影响分化过程¹⁰。同时，从小孔和试管中取出EB而不影响到它们的结构，操作起来也很有难度。图1所示的优势的方法为悬滴培养。种植细胞的数量可控制悬滴EB的大小，EB的形状也不会受到任何人工塑料基质表面的限制。过去建立这些培养体系十分费时费力，因为您需要在平板的盖子上制备悬液再反转形成悬滴。为了给EB提供营养，研究人员需要将它们转移至另一个组织培养容器中，通常是细菌培养皿或低粘附力的培养皿中。

Perfecta3D^® 悬滴培养平板大幅改善了EB制备与培养流程。用户只需在每个小孔的上方加入一滴细胞悬液，孔板的几何构造就会引导细胞和培养基通过一个小洞，进而形成一个稳定的悬滴。滴入口位于每个培养孔的上方，可用来更换培养基，添加外源胞外基质、生长因子、小分子，也可用来加入细胞形成混合培养物。所有这些选项都为EB的分化操作带来了极大的便利性与可控性。能方便地为培养物添加养分，意味着悬滴培养物可避免EB聚集或粘附在培养皿底部，从而使培养时间显著延长。

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细胞多能性验证

当全新的PSC细胞系建立时，用户需对其进行评估，以确认其真实拥有多能性。对于人源PSC细胞系而言，传统的验证方法是包括体外的多能基因表达水平验证、表观遗传分析和EB形成分析，以及体内的畸胎瘤分析等（图3）。应用于小鼠PSC细胞系更严格的多能性检测方法，包括四倍体互补实验^{11, 12} 及宿主胚泡注射实验^{13, 14}, 都不适用于人PSC细胞系。一些科学家坚持认为畸胎瘤分析是验证人PSC多能性的检测法，是确定新细胞系多能性的必要手段。不过，业界对于畸胎瘤分析所采用的方法存在极大的分歧，都希望建立更为*的标准实验步骤，从而对新建立的PSC细胞系之间进行结果比较¹⁵。

图3 在肾囊下注射PSC所形成的整个畸胎瘤（A）。对包含中胚层（B，C），内胚层（D）和外胚层（E，F）的组织切片进行苏木精与曙红染色分析。图像源自¹⁶。比例标尺 = 100 μM

诱导多能干细胞(iPSC)系的制备成功率远远高过胚胎干细胞系，当畸胎瘤分析被认为十分关键时，该分析就更加显得费力、昂贵和耗时，也需要大量的实验动物。因此，如果畸胎瘤分析对于证明多能性的作用不可替代，或一组体外检测就已足够，那么在此之前对几个蛋白因子进行检测就显得十分重要了。

标准化的体外 EB形成操作可获得大小和数目*的细胞，如果和定量细胞谱系分析方法联用，在许多情况下可作为畸胎瘤检测的有效替代手段（图4）¹⁷。例如，由于iPSC的生物学与功能仍处于谨慎研究阶段，许多实验室正在针对人类疾病模型建立多能细胞系。作为疾病模型的实验室细胞系基本无需确定致瘤性，因此进行畸胎瘤分析就是浪费时间和资源¹⁸。iPSC能否制备出更优良的模型至今仍存在颇多争议，这已超出了此书的论述范围^19-21。此外，如果特定细胞类型/组织的胚胎发育过程已得到充分的研究，人们即可通过定向3D分化（请见下一节）来评估新建立PSC细胞系参与“正常”发育模型的能力，这是在畸胎瘤检测或自然EB分化操作中无法实现的²²。

图4 使用苏木精和曙红对EB切片进行染色，呈现外胚层（A）、中胚层（B）和内胚层（C）的分化。图像源自¹⁷。!!比例标尺 = 50 μM。

大限度提高分化效率

部分细胞类型和组织需3D培养才能实现PSC的大分化效率。胚胎发育不会发生在单层细胞，无数的研究案例说明了某一胚层的胞外信号如何影响相邻胚层的特性。例如，心脏特性只会出现在那些暴露于前内胚层（所分泌）信号的中胚层细胞中²³。实际上，相对于2D培养，人类PSC细胞的心脏分化在3D培养条件下效果更好。这很可能是因为3D培养时信号转导更接近生理状态，存在PSC源心脏支持细胞，同时存在更天然的心肌三维整体结构^{24, 25}。在胚胎发育过程中，一些外胚层表面区域会变厚，随后发育为感觉器官部分，如眼（光基板）和耳（耳基板）。这些区域的分化也需要二维培养条件无法方便形成的多层细胞结构。胚胎发生的复杂分化模式在3D培养条件下不会受限，因此在体外可能获得更好的重复性。实际上，已有一些案例证明感觉基板拥有令人惊讶的自组织（self-patterned）分化过程：可从精确激活的EB分化为内耳毛细胞（图5）和视网膜色素化表皮细胞^26-28。

图5 示意简图展示了PSC 3D分化为听觉基板进而形成感觉上皮的过程。图像源自²⁸。

结论

在3D环境下培养PSC拥有巨大的优势，不仅可以有效验证新建立细胞系的多能性，还能大限度达到实际的细胞分化效果。诱导天然EB分化且避免人为干扰的整体性方法是悬滴培养技术，目前3D Biomatrix公司的Perfecta3D的悬滴培养平板可帮助用户方便地实现这一操作。用户可以灵活添加试剂、小分子、胞外基质、额外的细胞和营养物质，同时可以维持悬滴状态，从而为创新和改良PSC分化方法提供了更多空间。如需了解关于3D培养的更多信息，请参见我们的3D细胞培养知识中心（3D Culture Knowledge Center）： http://3dbiomatrix.com/knowledge-center。
 

材料

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参考文献

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