siRNA干扰检测

原理：RNA干扰 (RNA interference, RNAi)技术，是将与内源mRNA 编码区同源的小片段(19 -23bp)外源双链 RNA(siRNA)导入细胞中，引发细胞中相应mRNA 高效特异性降解，从而导致特定基因表达沉默(knock down)的一种实验技术，其中通过构建表达载体表达siRNA是多种siRNA制备方法中有可能进行长期基因沉默研究的方法，siRNA 载体可以在细胞内直接转录出shrna ，其干扰效果等同于siRNA ，而且能够解决 siRNA干扰时间短的缺点。您只需提供需干扰基因的详细信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所属物种，本公司负责设计3条针对目的mRNA的siRNA 靶序列，在短时间内构建三个可用于目的mRNA干扰实验的siRNA 载体并为您进行后续的干扰实验研究。

siRNA干扰检测实验流程

◇ 选择siRNA表达载体 通过人工合成基因的方法将该序列克隆至Clontech公司的RNAi-Ready pSIREN系列表达载体中，该系列表达载体带有Pol III(U6)启动子，具有转染效率高、操作简单、rna沉默效果易于检测等特点，客户可根据需要进行选择。

◇ 设计siRNA靶序列

◇ 根据客户提交的目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19-21nt 长。

◇ 对于每条选定的siRNA 靶序列，设计 siRNA 正义链和反义链，以 loop(9nt or 10nt) 相连，形成稳定的发卡RNA，称为 shRNA(short hairpin RNA)。

◇ 合成模板 合成每条编码 shRNA的DNA 模板，并连接到 siRNA 载体相应的多克隆位点之间。连接产物转化DH5α大肠杆菌。

◇ 抽提阳性克隆质粒 公司试剂盒抽提阳性克隆载体并定量。

◇ 转染细胞 质粒直接转染或通过病毒包装后转染细胞，并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养。

◇ 干扰效果检测

◇ 基因水平上检测 提取RNA、反转录、Realtime PCR检测干扰效果(客户自备细胞系)。

◇ 蛋白水平上检测 Western Blot检测蛋白水平干扰效果(客户自备一抗)。

服务周期及价格

服务说明

◇ siRNA服务需客户与我们共同讨论实验方案，并提供靶基因名称、序列或GeneBank ID和希望插入载体的名称等，免费为您设计siRNA序列。

◇ 由于构建的siRNA表达载体中插入的片段可以形成hairpin结构，因此可能会影响测序。如果我们对质粒测序结果不理想时，将对由质粒扩增得到的PCR产物进行测序。