Brdu细胞增殖检测

BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时, 就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。该方法能对细胞增值进行迅速而稳定的测量, 而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。
 
操作步骤
1. 细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0 期。
2. 终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。
3. 弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。
4. 甲醇/醋酸固定10min。
5. 经固定的玻片空气干燥，0.3％H2 O2 -甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6. 5％正常兔血清封闭。
7. 甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8. 冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。
9. 按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。
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1. 提供新鲜的肝素或者EDTA抗凝的外周血；
2. 提供新鲜的培养细胞，提供新鲜组织，需要实验室制备成单细胞悬液。
 
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