产品简介

经亲和纯化的 mouse anti-rabbit IgG (Conformation Specific) HRP Conjugate antibody。

产品使用信息

推荐的抗体稀释度:1:2000

特异性/灵敏度

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) 可识别天然兔 IgG。该抗体可能与高浓度的变性[轻链] IgG 发生交叉反应。

来源/纯化

使用总天然兔 IgG 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

使用流程

蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒

注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O,混合。

2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ,混合。

3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack或 Red Loading Pack通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ,混合。

5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中,并混合。

6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。

7. 脱脂奶粉

8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。

9. 洗涤缓冲液: 1X TBST。

10. 牛血清白蛋白 (BSA) 

11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。

12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack

13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)

14. 印迹膜:本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 μm 孔径。

15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody。

16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。

2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。

3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直径的平板 500 μl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。

5. 取 20 μl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。

6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 μl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

注意:建议将预染蛋白分子量标准品(10 μl/泳道)上样,以验证转膜的效率,化蛋白质标准品(10 μl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。

3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。

4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。

2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent。混匀。

3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

溶液和试剂

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% Triton、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸、1 mM Na3VO4、1 μg/ml 亮抑酶肽:CST 建议在使用前立即添加 1 mM PMSF。

保存/存储方法

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM (pH 为 7.4) 、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

支持性数据

来源/同种型:小鼠

应用关键词:

WB- 蛋白质印迹法 IP-免疫沉淀法 IHC-免疫组织化学法 ChIP-染色质免疫沉淀法 IF-免疫荧光法 F-流式细胞术 E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性关键词:

H-人 M-小鼠 R-大鼠 Hm- 仓鼠 Mk-猴 Vir- 病毒 Mi-水貂 C-鸡 Dm-黑腹果蝇 X-爪蟾 Z-斑马鱼 B-牛 DG-犬 PG-猪 Sc-酿酒酵母 Ce-秀丽隐杆线虫 Hr-马 All-预期所有物种

背景

Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 仅会与天然 IgG 发生反应,并且不会结合变性和还原的兔 IgG 重链或轻链。进行免疫沉淀 (IP) 后再进行蛋白质印迹实验时,用于进行免疫沉淀的一抗的变性兔 IgG 轻链和重链在随后的蛋白质印迹实验中分别约为 25 和 50 kDa,并且通常会掩盖分子量相似的蛋白条带。Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 用作二抗可避免这个问题。