产品名称：NEB E6300S cDNA第一链合成试剂盒 逆转录试剂盒

产品货号：E6300

产品品牌：NEB (New England Biolabs)

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ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒含两种经优化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反应混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反转录酶和小鼠 RNase 抑制剂，M-MuLV 反应混合液含 dNTP 和经优化的缓冲液。该试剂盒还包含两种优化的反转录引物和无核酸酶水。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火。经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA。合成的第一链 cDNA 产物长度可超过 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高纯度的完整 RNA 对于灵敏的 RT-PCR 检测至关重要。RNA 的 A260/A280 比值应至少 1.7 或更高。

总 RNA 或 mRNA 均可用于反转录反应。总 RNA 通常足以进行大多数 RT-PCR 分析。不过，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分离试剂盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分离试剂盒（NEB #S1550）获得 mRNA。

检测所需的 RNA 量取决于目标转录本的丰度。通常推荐使用 1 ng 至 1 μg 的总 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 第一链合成反应
RNA 和引物在 70℃ 条件下变性 5 分钟，可以去除阻碍较长 cDNA 合成的二级结构。不过，可以在某些情况下省略此步骤（结果未发表）。

推荐在 42℃ 条件下温育一小时，以获得最高产量和最大长度。不过，许多靶标用较短的温育时间即可进行检测。例如，对于 2 kb cDNA 合成，温育 5 分钟就足够了。

选择反转录引物
Oligo d(T) 引物是大多数实验的首·选，因为它确保所有 cDNA 拷贝在 mRNA 的 3´ 端终止并产生最长的连续 cDNA。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火，从而防止在 polyA 尾的内部位点开始退火（1）。不过，如果需要，也可以选择另外两种引物。

随机引物混合液是经优化的六聚体和 d(T)23VN 引物混合液。该混合液能随机地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA（例如核糖体 RNA）。随机引物混合液产生的 cDNA 平均长度较短，可用于检测多个短 RT-PCR 产物。随机引物混合液在各种 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特异引物用于 cDNA 合成反应时，cDNA 产物只能用于扩增该转录本。RNA 起始量较低（低于 10 ng）且只需要一种特定的 cDNA 时，使用这种方法可以获得良好的结果。

推荐的引物浓度：
引物：终浓度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
随机引物混合液：6 μM
特异引物：0.1–1 μM

产品名称：NEB E6300S cDNA第一链合成试剂盒 逆转录试剂盒

产品货号：E6300

产品品牌：NEB (New England Biolabs)

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