简介

精密医学，特别是医学肿瘤学，已经显著启用，并加快了步伐，以液体活检为基础的诊断的出现。虽然针对循环无细胞DNA（cfDNA）的液体活检分析提供了有用的诊断信息，如突变负担，但由于从垂死的细胞中衍生出cfDNA，这些检测仅限于对疾病状态的静态评估。利用循环细胞外囊泡（EV）和EV相关货物（如无细胞RNA（cfRNA））的检测，这些分析物从活细胞和垂死的细胞中产生，为疾病提供了全面和动态的视图。使用 EV 和 cfRNA 进行液体活检测试的一个重要障碍是捐赠者标本的完整性。采集的患者血液样本经过时间依赖性降解，导致疾病非特异性 EV 和 cfRNA 增加，从而降低分析素测量的准确性和可重复性。为了克服这个脆弱性，我们开发了Streck RNA完整BCT（RNAC），这是其血液采集管，用于稳定细胞外囊泡和无细胞RNA的绘制时间浓度。样品完整性将有利于有兴趣直接分析EV组和间接分析cfRNA通过RT-PCR或下一代基于测序的方法。将此收集管纳入预分析工作流程将允许长途运输、批量和/或延迟样品处理，而对样品完整性或下游分析产生影响。

材料与方法

血浆样本制备：根据 IRB（内奥马哈克里顿大学），通过病毒#830575从健康献血者那里采集血液样本。等离子体使用一般双旋协议（1800 g x 15min 和 2800 g x 15 分钟）进行隔离，并在 -80 oC 下冷冻，直到使用。

EV分析：使用NanoSight NS300仪器（马尔文潘纳利科有限公司）对EV浓度和颗粒尺寸进行检测。冷冻血浆样品迅速解冻，在PBS中稀释1：50-1：500，并根据制造商的建议进行测定。

cfRNA分离和分析：血浆样品被迅速解冻，总核酸被分离使用QIAamp循环核酸套件根据制造商的建议miRNA协议（Qiagen公司）。样品解，从30分钟增加到60分钟。结转DNA耗尽，cfRNA使用无RNaseDNase集和RNeasy MinElute清理套件（均来自奇根）进行浓缩。无细胞RNA分析使用2100生物分析器与RNA 6000笔克套件（安捷伦技术公司，美国圣克拉拉）和Qubit RNA HS测定试剂盒（塞默-菲舍尔），都根据制造商的建议。

RNA-seq： 无细胞RNA使用NEBNext rRNA消耗试剂盒耗尽rRNA，然后使用NEBNext超II定向RNA库制备试剂盒进行测序，两者均根据所提供的说明。库被量化（NEBNext 库量化套件，用于照明）和大小使用在 4200 磁带站系统 （Agilent） 上运行的高灵敏度 D1000 屏幕磁带确定。使用高输出 v2.5 测序套件（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州）在 Illumina NextSeq 550 上对库进行池化和排序。所有数据都已输出并保存到基于云的 BaseSpace 服务器 （Illumina）。读取与人类基因组对齐，并分别使用 BaseSpace 应用程序 Top-Hat 对齐和 DESeq2 完成差异表达式。

结果

细胞外囊泡的绘制时间浓度的维持

图1.在环境温度下储存时，RNAC 样品中保持细胞外囊泡的浓度长达 7 天。9 个不同的捐赠者被吸引到 EDTA 和 RNAC BCT 中，等离子体被立即隔离（绘制时间）或 2 天、4 天和 7 天后环境条件存储。在此期间，平均整体颗粒大小保持不变（未显示数据）。（配对样品 t 检验，ns = 不显著，**= p≤0.01）。

cfRNA 浓度在 RNAC 中保持长达 7 天

图2。A.无细胞RNA浓度在RNAC中保持7天，当储存在环境温度（Qubit测定，n=6健康捐赠者）。B.从单个供体中分离出的 cfRNA 的生物分析器痕迹表明，在绘制到 EDTA BCTs 的血液中，小RNA物种的时间依赖性增加。 第 3 天和第 7 天 cfRNA 浓度维持在接近绘制时间水平，以接近绘制到 RNAC 的同一供体的时间水平。

测序库产量在 RNAC Out 中保存到 7 天（环境存储）

图3。A.总体测序库产量与无细胞RNA的输入量直接相关。虽然无细胞RNA水平随着EDTA样品环境条件储存时间的变化而增加，但总体库产量也增加。被吸引到 RNAC BCT 中的相同捐赠者保持库产量以绘制时间水平（配对样本 t 检验，ns = 不显著，**= p < 0.01，n=9 捐赠者）。B.相对测序库大小和产量为代表性的健康捐赠者（复合凝胶图像显示预期的+350nt片段大小每个库（红色箭头），这在EDTA增加，但保持基线水平在RNC）。C.单个库的脚本覆盖率在 EDTA 和 RNAC 样本之间类似，并且在 7 天环境条件存储过程中不会改变。D.与编码序列对齐的映射读取与绘制到 EDTA BCTs 的血液样本中的时间减少，并在绘制到 RNAC 中的相同供体中保持不变（从 9 个供者集的平均读取数）保持不变。

RNAC 中绘制时间等离子转录组维护

图4。在RNAC中，大于对数2倍的基因表达变化小化 —— 只有8个基因表现出变化，而EDTA BCTs（n=5捐赠者）中只有928个基因表现出变化。重要的是，在环境条件存储的 7 天中，非常丰富的成绩单（即规范化平均计数较高的成绩单）保持在接近基线水平。

结论

• Streck RNA 完整 BCT 保持血浆细胞外囊泡的绘制时间浓度长达 7 天，当血液在环境条件下储存。
• 从RNA分离出的血浆无细胞RNA完整BCT可用于通用RNA-seq工作流程，主要参数（转录覆盖率、映射读取、绘制时间血浆转录组）在抽血后立即与金标准EDTA BCT不一样。
• RNA完整BCT保持cfRNA的绘制时间水平，从而在血液储存环境条件下时，可获得长达7天的测序库产量。
• 血浆转录组维持在Streck RNA完成BCT到7天环境条件存储。

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