Omega-质粒提取试剂盒

操作步骤： 

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式

离心机在室温下离心。 

1、取1-5ml酵母培养物（不超过 5×107cells），12000rpm离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 

2、酵母细胞壁的破除： 

A、酶法：向酵母菌体中加入 470ul 山梨醇 Buffer，充分悬浮菌体，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul β-巯基乙醇，充分混匀，30℃处理 1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm 离心 1min，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入 250ul 溶液 YP1（请先检查是否已加入 RNaseA） ，充分悬浮沉淀。注意：如果菌块未*混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。 

B、玻璃珠法：向酵母菌体中加入 250ul 溶液 YP1（请先检查是否已加入 RNaseA） ，充分悬浮沉淀。加入 150-200ul酸洗玻璃珠（自备），漩涡振荡 10min。简短离心使玻璃珠沉降到离心管底，吸取上清（如上清有所损失，请用溶液 YP1 补足 250ul）于另一干净离心管中。 

3、向离心管中加入 250ul溶液 YP2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以

免污染细菌基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏。 

4、向离心管中加入 350ul溶液 YP3，立即温和地上下翻转 6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心 10 min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液 YP3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱重新放回收集管中。 

6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

7、向吸附柱中加入 500ul漂洗液，12000rpm离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 

8、12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。 

9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul 经 65℃水浴预热的洗脱液，室温放置 2min，12000rpm离心 1min。 

10、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置 2min， 12000rpm离心 1min。  

注意事项： 

1、使用前请先检查溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。 

2、洗脱缓冲液体积不应少于 50ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的 pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 将水的 pH 值调此范围)，pH 值低于 7.0 会降低。洗脱效率；DNA产物应保存在-20℃，以防 DNA降解。 

3、质粒得率与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或分光光度计法都很难检测到，可通过 PCR或转化大肠杆菌来检测。 

4、DNA浓度及纯度检测：得到的基因组DN**段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DN**段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰， OD260值为 1 相当于大约 50  μg/ml双链DNA、40  μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。 

Omega-质粒提取试剂盒