PCR纯化Kit
货号：D6492-01
规格：100/盒
品牌：omega

     聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增十万乃百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

    PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性→退火→延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系：
    1、引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1～0.5μM，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30T。以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，但浓度过低则得不到产物或产量过低。

    2、Taq酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，但保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。另一种为在大肠杆菌合成的基因工程酶。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5～5U/100μl，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

    3、dNTP：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。多次冻融会使dNTP降解，一般存储浓度为10mM，小量分装，-20℃冷冻保存。在PCR反应中，dNTP浓度一般为50～200μM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。高浓度dNTP可加速反应，但同时会增加错误掺入和实验成本；低浓度dNTP可提高PCR的性，但反应速度和PCR产物的产量会降低。dNTP能与Mg 2+ 结合，使游离的Mg 2+ 浓度降低。

    4、模板：就模板而言，影响PCR的主要指模板的数量和纯度。一般PCR反应中模板的数量为10 2 ～10 5 个拷贝，灵敏的PCR甚可从一个细胞、一根头发、一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般要求不是很高，某些扩增实验中甚将裂解液直接作为PCR模板。但模板中不能有影响扩增反应的物质存在，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉类物质等，上述物质的存在会影响扩增效果，甚使扩增失败。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。

    5、Mg 2+ ：Mg 2+ 浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。一般PCR反应中，当dNTP浓度为200μM时，Mg 2+ 浓度为1.5～2.0mM为宜。Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，Mg 2+ 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。此外，Mg 2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。

PCR反应条件：
    1、变性温度与时间：变性温度低，解链不*是导致PCR失败的主要原因。一般情况下，93℃～94℃/min足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物*变性，就会导致PCR失败。
    2、退火温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
   复性温度=Tm值－(5～10℃)
   在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60秒，足以使引物与模板之间*结合。
    3、延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
    4、循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40T之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

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