氨基转换作用

目的要求

1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2、学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应。

实验原理

    体内a-氨基酸的a-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至a-酮酸的过程，称氨基转换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

     本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙酮酸氨基转换酶的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。

   由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基转换过程的观察，因此在反应体系中添加碘醋酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。

试剂和器材

1、试剂

1%谷氨酸溶液；1%丙酮酸钠溶液；0.1%KHCO3溶液；0.025%溴醋酸溶液；2%Hac溶液；0.1%标准谷氨酸溶液；0.1%标准丙氨酸溶液；1%KOH溶液。

展开剂；酚饱和水溶液（2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24h后分层，取下层酚置瓶中备用）。

显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

2、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g，置研钵中，加0.9%氯化钠溶液6mL，在低温下研磨成细浆，离心5min，弃去沉淀，得肌肉糜提取液。

3、器材

试管1.5cm×15cm（×4）；研钵；毛细管；烧杯；恒温水浴；培养皿9cm（×2）；直径13cm圆形滤纸；喷雾器；吹风机。

操作方法

1、转氨酶作用

（1）、取试管2支编号（1、2），向每个试管各加0.5mL谷氨酸溶液，0.5mL  1%丙酮酸钠溶液，0.5mL 0.1%KHCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸，混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5mL，混匀，将其中一支试管立即在沸水浴中加热2～3min做对照。用塞子塞住另一支试管，置于45℃水浴中保温60min。

（2）、保温完毕，取出试管。向每支试管中各加2%Hac溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白质*沉淀。过滤收集滤液代用。

2、层析验证

（1）、取培养皿一个，加入酚水饱和溶液，约0.5cm高。取圆形滤纸一张，在中心剪一直径1～2mm的小孔，并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四个等距离的原点并表明1,2,3,4。

（2）、用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸，依次点在标明号码的原点处，以吹风机吹干，再重新点样2～4次。注意斑点不能太大，一般直径约0.3cm为宜。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一条滤纸卷成筒状，直径1～2nm，将此小筒插入滤纸中心小孔，使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。

（3）、当酚溶液扩展到距离纸边缘约1.5cm时，取出滤纸。用铅笔化下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用喷雾器喷以0.1%茚三酮溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf值，并解释之。

3、计算公式

Rf=原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离