Controllable NOdonor<NO-Rosa5>

在任意范围、时间通过可视光照射释放NO的试剂

Controllable NOdonor<NO-Rosa5>是通过黄绿色可视光（530~590 nm）的照射释放出一氧化氮（Nitric oxide，NO）的Photo-controllable NO donor。利用光毒性低的可视光照射可以在时间空间上控制NO的释放，有利于各种细胞内信号传输相关的NO生理现象研究。

※本产品仅供科研使用。

※本产品基于名古屋市立大学的中川秀彦教授的研究成果商品化而成。

◆Memo

关于NO研究中Photo-controllable NO donor的意义及问题点

虽然一氧化氮是分子量仅有30的气体分子，但是在生物体内作为信号传输物质而发挥作用，因此阐明其生理意义是一项重要的课题。下文阐述了一些与NO研究相关的生理现象。

●　血管舒张（vasodilation）

●　神经传输（neurotransmission）

●　血小板黏附（platelet adhesion）

●　炎症反应（inflammation）

NO的气体分子是通过生物体内的NO合成酶产生，但在生理条件下极其不稳定，半衰期约为几秒左右。因此，NO被认为是在生物体内产生后，仅在非常狭小的范围（<100 μm）内起作用的局部信号传输物质，因此，期待能够阐明NO作为媒介参与的局部信号传输的意义。然而，由于NO是不稳定的气体分子，难以用于实验中，于是NO donor便被用于验证NO生理效果。

NO donor是在水溶液中分解，并缓慢释放NO的化合物群的总称。不同NO释放效率以及半衰期各异的化合物被开发成各种产品。然而，使用以前的NO释放剂，会使实验溶液全部均一地释放出NO，导致很难观察到原来的NO作用于局部的瞬时效果。为了解决该问题，近年来已开发出几种光反应性的NO donor如“Photo-controllable NO donor”，1） 需要UV光的试剂类，或2） 主要使用金属络合物的试剂类，但无论哪种都有难以适用于活细胞实验的缺点（参照表格）。

名古屋市立大学的中川秀彦教授等人克服了至今的问题，成功开发出不含金属络合物，毒性低且能在时间空间上控制NO释放，并通过可视光控制的Photo-controllable NO donor——NO-Rosa5（Controllable NOdonor）。使用本产品，可以在任意时间以及任意局部控制NO释放，作为研究NO的新工具而备受期待。

◆参考文献

◆原理

本试剂将Rosamine色素骨架用作光吸收天线，在吸收黄绿色光（530~590 nm）时，诱导光致电子转移(PeT: Photoinduced electron Transfer)，释放出NO。

◆特点

●　通过黄绿色光（530~590 nm；大吸收λmax～560 nm）引发NO释放。

●　非光照射时，NO释放量被抑制在极其微小的程度^*1 。

●　推荐使用浓度10 μM，未发现细胞毒性。

●　已验证了在培养细胞系，ex vivo主动脉血管舒张实验中的生物活性。

●　已证实显微镜的543 nm射线（He- Ne射线）以及氙灯可作为光源使用。

*1 请务必注意实验中的环境光线。

◆操作方法概要

※以下实验步骤仅供参考。请根据具体实验目的进行探讨。

1.　制备含有Controllable NOdonor的培养基

2.　去除培养基

3.　更换含有Controllable NOdonor的培养基^*2

4.　培养30分钟以上

5.　在任意时间、部位进行光照，然后进行各种成像^*3 或生化学分析

*2 也可不更换培养基，直接添加Controllable NOdonor。

*3 各种成像中使用荧光物质作为检测系统时，需要注意荧光物质的选择。详见下文中的“实验指导”。

实验注意

本产品有可能因实验环境的光线（室内荧光灯或阳光）分解，释放出NO。在制备溶液以及进行实验时尽量保持避光。

◆应用实例

 ■　通过NO电极定量NO释放活性

作为in vivo NO释放模型，用黄绿色光（530~590 nm带通滤波器）照射含10 μM Controllable NOdonor、100 mM HEPES（pH7.3）、0.1% DMSO的溶液，通过NO电极定量释放的游离NO浓度。连续300秒照射时，大可观察到4 μM的NO（左）。照射时间每20秒脉冲一次时，则可观察到阶段性的NO释放。随着试剂消耗，NO的释放量也逐渐减少（右）。

 ■　使用NO检测试剂实现NO释放活性可视化

用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM（10 μM）前处理HEK293T细胞30分钟后，用PBS清洗细胞，在添加Controllable NOdonor的条件下培养30分钟。使用NO检测试剂DAF-FM的荧光强度观察氙气光源（带通滤波器 530~590 nm）照射前后细胞内的NO量。由于光照后DAF-FM的荧光强度显著增强，可以看出通过光照促使NO释放。

 ■　通过局部的光照使特定部位释放NO

用荧光NO检测试剂DAF-FM DA（10 μM）前处理HEK293T细胞30分钟后，用PBS清洗细胞，在添加Controllable NOdonor的条件下培养60分钟。使用共聚焦显微镜的543 nm射线光照白圈部分（直径31 μm），通过DAF-FM检测NO的释放。可以确认仅白圈部分释放出NO。使用本试剂，可通过光在时间空间上控制NO的释放。

 ■　ex vivo 血管舒张实验

将分离的大鼠主动脉切片浸于填满Krebs缓冲液的Magnus 试管中，并添加抑制内源性NO产生的NO合成酶抑制剂L-NAME（100 μM）。接着，添加去甲肾上腺素（10 μM）使血管进入收缩状态。即使用绿光（530~590 nm）照射3分钟，也未发现光自身对血管收缩有效果（图中①）。但添加Controllable NOdonor（10 μM）后照射绿光则可观察到明显的血管舒张（图中②④）。停止光照后，再次发现血管收缩（图中③⑤）。虽然sGC（soluble guanylyl cyclase）-cGMP路径参与NO引起的血管舒张，但在该状态下添加sGC抑制剂ODQ（10 μM）的话，绿光照射也能抑制血管扩张（图中⑥）。实验结果可以看出使用Controllable NOdonor通过光照能够控制血管舒张。

 ■　评价细胞毒性

向HEK293T细胞中分别添加10（推荐浓度）、30、100 μM的Controllable NOdonor并培养48小时后，使用WST-8分析评价细胞存活率。30 μM以下的细胞存活率得以维持，但在高浓度的100 μM中发现了细胞毒性。本试剂推荐使用10 μM。

◆实验指导

光谱信息

Controllable NOdonor拥有下图所示的吸收和荧光光谱。530~590 nm的光照可以有效地释放出NO。另外，由于含有Rosamine骨架，请注意在500~600 nm的光照下激发，会观察到红色荧光。

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荧光染料选择指导

由于Controllable NOdonor在500~600 nm光照下会释放NO，在实验中同时使用荧光物质（荧光色素，荧光检测试剂，荧光蛋白等）时，请务必注意以下几点。建议提前探讨Controllable NOdonor的荧光特性是否会影响目的荧光物质的观察。

（1）避免使用红色荧光物质

原因如下，在500~600 nm范围内不推荐使用含有激发波长的红色荧光物质。

1.　通过激发光的照射，诱导Controllable NOdonor的NO释放。

2.　观察到Controllable NOdonor的Rosamine骨架来源的荧光。

（2）可同时使用的荧光物质

以下波长范围的荧光物质可以与Controllable NOdonor同时使用。

激发波长<500 nm的荧光物质（蓝色荧光物质或绿色荧光物质等）

激发波长>600 nm的近红外荧光物质

※确认NO的释放推荐使用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM DA

◆产品列表