大鼠内皮素(ET)ELISA检测试剂盒实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠内皮素 (ET)水平。用纯化的大鼠内皮素(ET)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内皮素 (ET)再与 HRP标记的内皮素 (ET)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮素 (ET)呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠内皮素 (ET)浓度。

大鼠内皮素(ET)ELISA检测试剂盒组成：

试剂盒组成  48 孔配置  96 孔配置  保存

说明书  1 份  1 份 

封板膜  2 片（48）  2 片（96） 

密封袋  1 个  1 个 

酶标包被板  1×48  1×96  2-8℃保存

标准品：135μg/L  0.5ml×1 瓶  0.5ml×1 瓶  2-8℃保存

标准品稀释液  1.5ml×1 瓶  1.5ml×1 瓶  2-8℃保存

酶标试剂  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

样品稀释液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

显色剂 A 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

显色剂 B 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

终止液  3ml×1 瓶  6ml×1 瓶  2-8℃保存

浓缩洗涤液  （20ml×20 倍）×1 瓶  （20ml×30 倍）×1 瓶  2-8℃保存

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心20分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞

浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分

2钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上

进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

大鼠内皮素(ET)ELISA检测试剂盒操作步骤：

1.  标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在*、第二孔中分别加标

准品 100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后从*孔、第二

孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、 第四孔分别加标准品稀释液 50μl，

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各

取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混

匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准

品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。 （稀释后各孔加样量都为 50μl，

浓度分别为 90μg/L，60μg/L ，30μg/L，15μg/L，7.5μg/L） 。

2.  加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待测样品孔。 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl， 然后再加待测样品 10μl（样品zui终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.  温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4.  配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此

重复 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

7.  温育：操作同 3。

8.  洗涤：操作同 5。

9.  显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15 分钟.

10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项 ：

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间

控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值

大于标准品孔*孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计

3算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5） 。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物请避光保存。

7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9． 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算 ：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

大鼠内皮素(ET)ELISA检测试剂盒性能 ：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。

2.批内与批见应分别小于 9%和 11%

检测范围 ：

3μg/L -120μg/L

保存条件及有效期 ：

1.试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期：6 个月