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Protein G琼脂糖凝胶通常用于从血清、细胞培养上清或腹水中分离抗体,以及从细胞或组织提取物中分离抗原进行免疫沉淀和免疫共沉淀。蛋白G琼脂糖偶联高质量的重组蛋白G,它可以结合抗体的IgG结合域,这些结构域可以与许多不同物种的抗体结合,包括小鼠、人、兔、猪、狗和猫。
订购信息
产品名称 | 货号 | 规格 | 价格 |
Protein G琼脂糖凝胶 | AP64L223 | 1 mL | 400 |
运输与保存
常温运输。4℃保存,有效期24个月。
技术参数
介质 | 4%高度交联的琼脂糖微球 |
大小 | 30-100um |
浓度 | 25% |
结合力 | ≥ 6 mg human IgG/mL of beads |
适用范围 | IP,CoIP, ChIP |
使用方法
悬浮细胞样品
1.4℃、500-1000 g、10 min,收集细胞,弃上清。
2.用PBS 洗细胞一次,即用 PBS 将细胞团重悬,4℃、500-1000 g、10 min,收集细胞,弃上清。
3.用预冷的IP Lysis/Wash Buffer重悬细胞。每50mg 细胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同时加入PMSF等相应的抑制剂,混匀后置于冰上静置5-20 min(期间混匀几次)。
4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min离心收集上清液,置于冰上以备后续实验(或置于-80 ℃长期保存)。
血清样品
一般建议建议用IP Lysis/Wash Buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150 µg/mL,置于冰上备用(或置于-20 ℃长期保存)。
免疫复合物的制备
【注】:样品所需的量和孵育时间均依赖于每个特定的抗体-抗原体系,因而可能需要优化才能得到最大产量。
以下实验方案针对2-10μg 亲和纯化的抗体,根据需要可以按比例放大。
1.在离心管中,将每个样品的细胞裂解液与2-10μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1500μg。
2.用IP Lysis/Wash Buffer将抗体以及制备好的样品稀释至300-500μL。
3.在室温下孵育1-2 h,或4 ℃过夜,以形成免疫复合物。
免疫沉淀
【注】:为保证微球均匀分布,使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中微球。
1.将25µLProtein G琼脂糖加入1.5 mL 离心管中。
2.向离心管中加入500 µL 预冷PBS,轻柔混匀。
3.然后4℃、1000g离心5min,去除上清。
4.向离心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min。4℃、1000g离心5min,去除上清。
5.将抗原样品/抗体混合物加入装有Protein G琼脂糖的离心管中,保持混匀室温下孵育1-2 h,或4℃过夜。
6.4℃、1000g离心5min,除去未结合的样品,保存以备分析。
7.向离心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer,轻柔混匀。4℃、1000g离心5min收集琼脂糖,弃上清。再重复洗两次。
8.向离心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer(1×),将样品置于100℃水浴或者金属浴中加热10 min。离心后,保留含有目的抗原的上清。
注意事项
1.本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
2.请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠,这些操作会导致微球聚集而降低结合能力。
3.IP实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会受到IP Lysis/Wash Buffer的影响,因此,如使用本实验步骤不能获得最佳的实验结果,可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验,推荐使用李记生物的相关产品,参照相关产品推荐。
4.琼脂糖使用前应充分振荡均匀。琼脂糖应保存在储存溶液中,防止干燥。
附录:蛋白G与不同种类的Ig,s及其亚类的结合强度
Species | Antibody Subtype | Protein A | Species | Antibody Subtype | Protein A | Species | Antibody Subtype | Protein A |
Human | Total IgG | +++++ | Mouse | Total IgG | +++ | Cow | Total IgG | +++++ |
IgG1, IgG2 | +++++ | IgM | – | IgG1,IgG2 | +++++ | |||
IgG3 | +++++ | IgG1 | +++++ | Goat | Total IgG | +++++ | ||
IgG4 | +++++ | IgG2a ,IgG2b | +++ | IgG1,IgG2 | +++++ | |||
IgM | – | IgG3 | +++ | Sheep | Total IgG | +++ | ||
IgD | – | Rat | Total IgG | +++ | IgG1, IgG2 | +++ | ||
IgA | – | IgG1 | +++ | Horse | Total IgG | +++ | ||
IgA1, IgA2 | + | IgG2a | ++++++ | IgG(ab),IgG(c) | + | |||
IgE | +++ | IgG2b | +++ | IgG(T) | +++++ | |||
Fab | +++ | IgG2c | +++++ | Monkey | Total IgG | +++++ | ||
ScFv | + | Pig | Total IgG | +++ | Chicken | Total IgG | – | |
Rabbit | Total IgG | +++++ | Donkey | Total IgG | +++++ | Notes: | + weak binding | +++ medium binding |
Guinea Pig | Total IgG | +++ | Cat | Total IgG | +++ | +++++ strong binding | – no binding | |
Hamster | Total IgG | +++ | Dog | Total IgG | +++ |
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