SYTO 9活细菌/死细菌双染试剂盒产品简介：

（SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit）是一款方便且操作简单的试剂盒，利用SYTO 9绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料来进行细菌活力的检测，适用于大量的细菌种属，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝杆菌、绿脓杆菌、Staphylococcus aureus、奥拉尼堡沙门氏菌、宋内志贺氏菌和化脓性链球菌。

SYTO 9活细菌/死细菌双染试剂盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光谱特征以及穿透健康细菌细胞的能力不同。单独使用时，SYTO 9能对群体内的所有细菌进行标记—具有完整膜和受损膜的细菌；相反，PI只能渗透进入受损的膜，PI的插入会引起SYTO 9染色荧光的降低，当体系内加入两种染料时。因此，通过适量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜结构的细菌呈绿色荧光，而具受损膜结构的细菌呈红色荧光。两者染料的最大激发和发射波长分别是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本无荧光。本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。

产品组成：

【注】组分C荧光显微镜检测方法中才会应用的到，具体用法见注意事项3)。

试剂盒规格说明（按照建议的试剂稀释倍数和单次测试体积来计算）：保存与运输方法:-20℃避光保存，有效期一年。 冰袋运输。

荧光显微镜检测：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl），可做40次独立测试。

荧光酶标仪检测：2ml无菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl），制备成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次独立测试。

流式细胞仪检测：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl），可做20次独立测试。

使用方法(以下步骤仅用作示例以指导科研人员开展自身细菌样本的染色。)

一、培养条件和细菌悬液的制备：

【注意】：用本试剂盒进行细菌染色，务必要小心去除培养基残留，因为，核酸和其它培养基成分可能以不可预料的方式与SYTO 9和PI结合，导致染色结果发生不可接受的变动。简单的一次清洗步骤通常足以去除培养基内含的培养基成分干扰物残留。不建议使用磷酸盐清洗缓冲液，因此可能降低染色效率。

1.1 用营养肉汤培养大肠杆菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生长至对数生长后期。

1.2 于10000×g离心10-15min，浓缩25ml细菌培养物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或适当缓冲液来重悬沉淀。

1.4 取1ml重悬菌液分别加入含20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30-40ml离心管（设置为活细菌组），用含20ml 70%异丙醇（也可以用其他方法比如高热处理杀死细菌）的30-40ml离心管（设置为死细菌组）。

1.5 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次。

1.6 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于10000×g离心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤1.6再离心一次。

1.8 分别用10ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。

1.9 分别取3ml菌液测定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路径）。

1.10 对于大肠杆菌或Staphylococcus aureus的建议染色浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。

二、染色条件的优化：

试剂盒内的两种染料都经过平衡优化，按照1：1的比例进行混合用于绝大多数的样本都能得到良好的区分活/死细菌。偶然情况下，两种染料的混合比例需根据实际需求进行优化调整。比如：在待检样本中，绿色荧光太突出，建议要么降低SYTO 9浓度，要么提高PI浓度。

为了全面优化染色条件，建议测试梯度浓度的SYTO 9，每一种浓度与梯度浓度的PI进行组合染色。建议按照1ml细菌悬液加入3µl不同混合比率的染料预混液。

[注]：SYTO 9 +PI 对细菌的染色请按照说明书建议的15min来操作，不要超过30min。 SYTO 9有很好的细菌渗透性，我们给的实验条件都是优化过。 SYTO 9只有在哺乳动物细胞染色，可能会延长染色时间到120min。

由于染的是活菌+死菌的比例，请染色后尽快观察，不要超过1h。 另，染色后基本是不用清洗的，除非觉得背景荧光很高，就是非细菌的菌体部分都能看到荧光，才有必要简单清洗一次。

三、荧光显微镜操作步骤：

活菌和死菌的荧光可能用标准的荧光素长通滤片设置来同时观察。替代方案的话，活菌（绿色荧光）和死菌（红色荧光）可分别用荧光素和Texas Red带通滤光片设置。用于本试剂盒检测的建议荧光显微镜滤片设置见表1。

表1 适用于本试剂盒检测用的常见滤光片特征：

3.1 在微量离心管内组合等量的组分A（SYTO 9）和组分B（PI），混匀。

3.2 每1ml细菌悬液内加入3μl染料预混液。按照建议的稀释倍数，最终得到的染色工作液内含0.3% DMSO。更高浓度的DMSO可能对染色产生副效果。

3.3 混匀后室温避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的细菌悬液到载玻片上，并盖上18mm方形盖玻片。

3.5 根据表1选择荧光显微镜上合适的滤片来观察。

四、荧光光度计操作步骤：

4.1 调整大肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为1×108个细菌/ml（~0.03 OD670）或Staphylococcus aureus悬液（活和杀死）使其密度为1×107个细菌/ml（~0.15 OD670）。用于荧光光度计检测，Staphylococcus aureus悬液的浓度通常比大肠杆菌少10倍。

4.2 参考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英荧光比色皿混匀五种不同比例的细菌悬液。每个样本的总体积为3ml。

4.3 在微量离心管内分别加30μl组分A（SYTO 9）和30μl组分B（PI），混匀。

4.4 每组不同比例的细菌悬液内加入9μl染料预混液（5个样本×9μl =45μl总量），用枪上下吹打数次使其混匀。

4.5 室温避光孵育15min。

4.6 荧光测定和数据分析：

①用荧光光度计测定每组细菌悬液（Fcell）的荧光发射光谱（激发：470nm，发射：490-700nm）

②分别测定发射光谱在510-540nm（em1，绿色）和620-650nm（em2，红色）的累积荧光，并计算累积荧光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制图

五、荧光酶标仪操作步骤：

针对细菌悬液，用荧光酶标仪的测定条件与荧光光度计的基本类似。如同荧光光度计的检测步骤，染料浓度相同于荧光显微镜的建议浓度，绿/红荧光比与活细菌相对数量呈正比。

5.1 调整大肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为2×108个细菌/ml（~0.06 OD670）或Staphylococcus aureus悬液（活和杀死）使其密度为2×107个细菌/ml（~0.3 OD670）。用于荧光酶标仪检测，Staphylococcus aureus悬液的浓度通常比大肠杆菌少10倍。

5.2 参考表3在16×125mm高硼硅玻璃培养管内混匀五种不同比例的细菌悬液（大肠杆菌或Staphylococcus aureus）。每个样本的总体积为2ml。

5.3 在微量离心管内分别加6μl组分A（SYTO 9）和6μl组分B（PI），混匀。

5.4 通过将所有的12μl上述预混液加入2ml无菌的dH2O，混匀后制备2×染色混合液。

5.5 吸100μl细菌悬液混合物到平底96孔板的各孔内，建议每个制备物做三个平行。96孔板的边缘孔通常空置以避免假读数。

5.6 更换新的枪头，每孔加入100μl 2×染色混合液，上下吹打使充分混匀。

5.7 室温避光孵育15min。

5.8 荧光测定和数据分析：

①以~485nm为激发波长，~530nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光

②以~485nm为激发波长，~630nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光

③通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以RatioG/R为纵坐标，制图

六、流式细胞仪操作步骤：

仪器的检测配置可能要因实际情况来调整，但此处列出的检测技术和设置参数适用于市场上绝大多数流式细胞仪。

6.1 调整大肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为1×108个细菌/ml（~0.03 OD670），之后用无菌dH2O稀释100倍使其最终密度为1×106个细菌/ml。

6.2 参考表4在16×125mm高硼硅玻璃培养管内混11种不同比例的细菌悬液。每个样本的总体积为2ml。

注意事项：

1由于试剂盒内SYTO 9和PI的组分量少，室温回温充分融化后，务必低速离心沉至管底后再开盖。

2两款探针溶液本身就是溶于DMSO中，所以后续无需再单独添加，第一次使用可将SYTO 9和PI根据单次用量分装保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3组分C（Mounting oil）主要应用于荧光显微镜检测法，菌液加到载玻片后，接着滴1-2滴组分C用于将细菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003。不要用作浸油（Immersion oil）。

4SYTO 9和PI结合核酸，PI是潜在的诱变剂，目前没有数据阐明SYTO 9的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。DMSO能促进有机分子进入组织。强烈建议处理DMSO储存液时戴双层手套。对于核酸染料，含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。

5为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。