【方法解读】DNA甲基化的检测方法
时间：2023-03-22 阅读：362
表观遗传学是研究DNA序列不发生改变的前提下，基因的表达发生可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰的研究内容包含DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA甲基化是人类最早发现的表观遗传修饰之一，属于非组蛋白表观遗传现象。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMTs）的催化下，将一个甲基（CH3）基团共价连接到胞嘧啶的5号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的过程。哺乳动物体细胞的DNA甲基化主要发生在CpG岛（CpG islands，C指胞嘧啶，G指鸟嘌呤，p指连接CG碱基的磷酸）。研究结果表明，基因调控元件（如启动子）的CpG岛发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关，非甲基化一般与基因的活化相关，而去甲基化一般与沉默基因的重新激活相关。
细胞的表观遗传修饰与细胞代谢、癌症、衰老、心血管疾病及神经退行性疾病等多种疾病相关。受环境，疾病，性别和年龄等因素影响，DNA甲基化水平处于动态的变化过程。不同个体、组织与细胞之间，甚至是同一个体或细胞的不同发育时期，DNA甲基化的程度和状态都可能存在差异。研究表明，DNA甲基化在基因调控、蛋白质表达、胚胎发育、细胞分化、X染色体失活以及疾病和肿瘤的发生、发展等过程中起重要的调节作用。
DNA甲基化具有重要的生物学功能，科学家们开发了大量的方法检测DNA甲基化水平。
目前常见的DNA甲基化测定方法包括以下几类：
1. 基因组甲基化水平的分析方法：包括高效液相色谱（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPCE）。
2. 候选基因甲基化分析方法：包括甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亚硫酸盐测序法（Bisulphite Sequencing）、甲基化特异性的PCR（MS-PCR）、甲基化荧光法、焦磷酸测序（Pyrosequencing）、以及结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）等。
3. 基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱方法：包括限制性标记基因组扫描（RLGS）、甲基化间区位点扩增（AIMS）、甲基化CpG 岛扩增（MCA）、差异甲基化杂交（DMH）、由连接子介导PCR出的HpaII小片段富集分析、以及甲基化DNA免疫沉淀法等。
三、使用微孔板读板机测定DNA甲基化
1. DNA甲基化检测
DNA甲基转移酶催化甲基基团共价连接到胞嘧啶的5号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），5mC是最早被发现，也是研究最多的修饰碱基，在基因表达调控、生物生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳动物胚胎干细胞和人、小鼠脑细胞中表达的一种修饰，它可以把胞嘧啶羟甲基化。DNA 甲基化水平是一个DNA 甲基化和DNA 去甲基化的动态调控的过程。研究结果表明，5mC可以导致基因沉默或基因表达水平降低，而5hmC作为去甲基化过程的第一步，会导致基因激活或基因表达水平升高。分析5mC和5hmC在不同细胞和基因组不同区域的含量和比例，对于确认健康和疾病的细胞/组织中的甲基化修饰变化具有重要意义。高效液相色谱法（HPLC）, 薄层色谱法（TLC）和质谱等基于层析的技术都可以被用来检测5mC和5hmC，但是它们步骤复杂，耗时，且成本较高。
利用微孔板读板机（酶标仪）进行DNA甲基化相关实验测定灵敏度高，特异性好，并且整个操作步骤简易，快速。可以利用Molecular Devices酶标仪，结合DNA甲基化检测分析试剂盒，通过光吸收法或荧光法定量检测不同样本的甲基化DNA（5mC）和羟甲基化DNA（5hmC）。
DNA甲基化是表观遗传学的重要部分，DNA甲基化模式的改变会导致肿瘤及多种疾病的发生，例如在很多肿瘤中都发现DNA甲基转移酶（DNMTs）的表达异常。对DNA甲基转移酶的研究不仅可以揭示DNA甲基化对基因表达调控的机制，对肿瘤等疾病的治疗也具有潜在意义。
Elisa作为传统的方法，存在实验步骤多，需要经过多次洗板、加样、显色等操作步骤，耗时长，结果不稳定等不足。可以利用Molecular Devices酶标仪，结合均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）的方法检测甲基转移酶，这种检测方法适合几乎所有甲基转移酶和底物的检测，操作步骤简单、灵敏度高且无放射性污染。
优势：
• 拥有 HTRF 兼容性认证，确保仪器性能
• 高度稳定、均质的高通量检测
• 使用 SoftMax Pro 软件更快地获得结果
• 拥有 HTRF 兼容性认证，确保仪器性能
• 高度稳定、均质的高通量检测
• 使用 SoftMax Pro 软件更快地获得结果