外包服务 real-time PCR，荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。2）取100mg组织，加入到匀浆器中。3）充分研磨直至无可见组织块。4）13000g离心10min取上清。5）加入250 μl，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。6）4℃下13000g离心8min。7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。8）-20℃放置15min。9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。11）4℃下13000g离心5min。12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。14）55℃孵育5min。2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。2）加入1μl oligo(dT)15。3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM内参引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR扩增预变性 95℃，10min循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃4、结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)K=A-B表达倍数=2-K

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