EHA101  Electroporation-Competent Cell   根癌(电击)感受态细胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR)Nopaline

简要说明：

EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——li福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：kan，赋予EHA101菌株ka那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。EHA101电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pK7WGF2质粒 (zhuang观霉素抗性，size:11876 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA。

操作说明：

1.0.2cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5ug质粒DNA（质粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手bo打管底混匀，立即插入冰中，用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3.启动电转仪，设置参数：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700ul 无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50ug/ml kan 时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h）。

注意事项：

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在盐，乙醇等污染，转化效率急剧下降；若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.混入质粒时应轻柔操作。

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4.li福平浓度不应高于25ug/ul，过高的li福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2。

5.培养基中加入li福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入lian霉素或qing大霉素可防止Ti质粒丢失，但lian霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑lian霉素或请大霉素，Ti质粒丢失的概率极低（可以忽略）。