NMY51 Chemically Competent Cell  酵母感受态细胞

基因型：

MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4

简要说明：

DUAL membrane系统是专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformationmarker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-C，pBT3-SUC，pBT3-STE，筛选标志均为LEU；四种Prey质粒：pPR3-C，pPR3-N，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。

操作说明：

1. 取pBait-AbAi质粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg（体积不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重复一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，PEG/LiAc 500µl，轻轻翻转混匀6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亚砜（用以提高转化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6-8次；

6. 12000rpm瞬时离心弃上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃复苏1h（用以提高转化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬时离心弃上清，用100µl 0.9% NaCl重悬，涂板，30℃培养48-96h。

注意事项：

1.PEG在低温下易析出，请在常温下wan全溶解后使用。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。