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Azaood-Fetal Bovine Serum(Standard South American
面议Azaood-Fetal Bovine Serum( New Zealand Origin)
面议Fast One Step Cloning Kit
面议Universal SYBR Green qPCR Mix
面议All-in-One RT SuperMix for qPCR试剂
面议ESF 921昆虫细胞培养基
面议线性PEI 转染试剂
面议ES培养基昆虫及哺乳动物细胞
面议培养基Helios UltraGRO 血清替代物
面议预染蛋白Marker26617试剂
面议线性PEI转染试剂- KE1082
面议杂交瘤细胞无血清培养基
面议产品名称:EZ细胞及动物组织RNA直扩RT-PCR试剂盒(一步法)
英文名称:EZ Cell and Tissue RNA Direct PCR Kit(One Step)
产品规格:30T/100T
产品报价:1200元/3000元
试剂盒应用:细胞组织或细胞基因的扩增与克隆、RNA病毒基因的扩增、RNA病毒PCR诊断、RNA病毒Real-time PCR.。
试剂盒组成:RNA-EZ-1、RNA-EZ-2、RNA-EZ-3、RNA-EZ-4、RT-Enzyme、2*RT-Buffer、ddH2O
保存条件:-20ºC保存。使用前将RNA-EZ-1、RNA-EZ-4在室温或37ºC充分溶解。RNA-EZ-3、RNA-EZ-4和RT-Enzyme使用时需置于冰上。
使用方法:
细胞中RNA的扩增
(1)将6ul RNA-EZ-1与3ul RNA-EZ-2充分融合。
(2)取20ul细胞悬液(10^5-10^6cells/ml),加入上述混合液,混匀。
(3)置于37ºC静置10分钟。
(4)加入1ul RNA-EZ-3,混匀。
(5)置于37ºC静置15分钟。
(6)置于98ºC加热5分钟。
(7)加入60ul的RNA-EZ-4,混匀。
(8)取2ul(7)中处理液进行RT-PCR扩增。
组织块中RNA的扩增
(1)用 H2O 将 RNA-EZ-1 稀释 5 倍,每 25 μL 的 RNA-EZ-1 稀释液中加入 3 μL 的 RNA-EZ-2,混合均匀。同时处理多个组织块时,可以按照以上比例配制预混液并分装到每个离心管 26 µL。
(2)切取半颗米粒大小的组织块(< 3 mm3),*浸入上述混合液中。
(3)置于 37ºC 静置 10 分钟。
(4)加入 1µL RNA-EZ-3,混匀。
(5)置于 37ºC 静置 15 分钟。
(6)置于 98ºC 加热 5 分钟。
(7)加入 60 μL RNA-EZ-4,混匀。
(8)取 2 μL(7)中处理液进行 RT-PCR 扩增。
Real-Time PCR
取上述细胞或组织处理液,加入特异性引物和 TaqMan 探针,可进行特异性靶标 RNA 的定
量检测。如需进行 SYBR Green Real-time PCR,请选择 EZ021-01/-02(EZ® Cell and Tissue RNA Direct
PCR Kit(One Step))。
在 RNase free 的离心管中配制 PCR 反应体系
| 25 μL 体系(推荐) | 50 μL 体系 |
2×RT-Buffer | 12.5 μL | 25 μL |
RT-Enzyme | 1 μL | 2 μL |
Forward Primer (10 μM) | 1 μL | 2 μL |
Reverse Primer (10 μM) | 1 μL | 2 μL |
Template DNA | 2 μL | 2 μL |
RNase free ddH2O | 7.5 μL | 17 μL |
按照以下方法设定 PCR 反应
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
反转录 | 50 ℃ | 30 min |
|
预变性 | 94 ℃ | 3 min |
|
变性 | 94 ℃ | 30s | 30-35 |
退火 | 50-72 ℃ | 30s | 30-35 |
延伸 | 72 ℃ | 30s-3min(1 kb/min) | 30-35 |
终延伸 | 72 ℃ | 10min |
|
| 4 ℃ | Hold |
|
EZ细胞及动物组织RNA直扩RT-PCR试剂盒注意事项
(1)取样的细胞量应当适中,浓度不宜过高或过低,处理后溶液应当以透明为宜。
(2) 样品处理过程中应当防止交叉污染,推荐设置阴性对照参与处理过程,以检测环境的污染。
(3)用本产品扩增的 RNA 不宜太长,1000bp 及以内的片段较佳,前期研究中可扩增长达 1800bp的片段,扩增片段越长效率越低。扩增的成功率也与 RNA 的丰度、二级结构以及引物等有关。
(4)本产品同样适用于相应的细胞或组织中 RNA 病毒的 PCR、Real-Time PCR 诊断。
(5)2×RT-Buffer 中加入了染料和相应试剂,可直接进行电泳,无需另加 Loading buffer。
(6)处理 96 孔板中的细胞时,可按照 ddH2O:RNA-EZ-1:RNA-EZ-2=20:5:3 的比例配制预混液,使用多道移液器直接加入 96 孔板经 DPBS 洗涤的细胞中,实现高通量操作。
(7)2×RT-Buffer 中的染料不影响 TaqMan 探针的效果。
细胞中RNA病毒短片段的扩增。取不同病毒感染的细胞20ul,用EZ020试剂盒进行直扩RT-PCR,均可稳定获得目的产物。
细胞中RNA病毒短片段的扩增。取不同病毒感染的细胞20ul,用EZ020试剂盒进行直扩RT-PCR,可扩增长达1800bp的RNA片段。
细胞中不同长度的RNA片段的扩增。取20ul BHK-21细胞,用EZ020试剂盒进行直扩RT-PCR,可稳定扩增各种长度的RNA片段。
同类型产品对比。用本产品、N公司以及T公司同类产品扩增某动脉炎病毒的RNA片段,发现本产品与同类产品相比具有较高的扩增效率。