2-8℃避光

1.开盖前请离心。
2.开盖后组份按要求条件保存。
3.拆封后请尽快使用完！

1年

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
2.快速：1小时内即可完成实验；
3.准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。
4.由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此在染色后立即进行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。

样品染色：
1. 离心收集悬浮细胞。离心机约300×g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 用400 μl 1X Annexin V结合液重新悬浮细胞，浓度大约为1×106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-EGFP染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入5-10 μl PI染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育2-5分钟。 6. 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
3. 细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。
4. 细胞数量偏少。增加细胞数量。
5. 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的，或者消化后用PBS洗涤干净。

实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。

1.Hongjuan Li, et al.
Nucleus-targeted nano delivery system eradicates cancer stem cells by combined thermotherapy and hypoxia-activated chemotherapy
Biomaterials 2019 （IF=10.317）

2.Wei Bing, et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=11.459）

3.Linchong Sun, et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=20.507） 4.Kerong Deng, et al.
Enhanced Antitumor Efficacy by 808 nm Laser-Induced Synergistic Photothermal and Photodynamic Therapy Based on a Indocyanine-Green-Attached W18O49 Nanostructure
Advanced Functional Materials 2015 （IF=16.836）

5.Wenqiao Zang, et al.
miR-663 attenuates tumor growth and invasiveness by targeting eEF1A2 in pancreatic cancer
Molecular Cancer 2015 （IF=15.302）