01 实验介绍

明暗箱实验也叫光/暗转换测试 (LDT) ，是用于测量小鼠焦虑样行为的*泛使用的测试之一。该测试基于小鼠对明亮区域的自然厌恶以及它们对轻度压力源（例如新环境和光线）的自发探索行为。该测试对抗焦虑药物治疗也很敏感。测试装置由一个盒子组成，盒子分为一个小（三分之一）暗室和一个大（三分之二）明亮的照明室。将小鼠放入照明的隔间中，并允许在两个室之间自由移动。进入暗室的第一个潜伏期和在亮室中花费的总时间是小鼠明亮空间焦虑的指标。由于随着时间的推移习惯化，转换是活动探索的指标。LDT 快速且易于使用，无需事先对动物进行培训。在这里，我们提出了我们的协议，该协议能够检测小鼠的抗焦虑样（减少焦虑）和类焦虑（增加焦虑）行为。02 材料和试剂

1. 纸巾
   

2. 实验室饲养的小鼠
   关键注意点：小鼠在每笼 3-5 组中饲养，在 12 小时光照/黑暗循环（上午 7:00 开灯）下保持在温度（~23°C）和湿度可控的房间内，随意获得食物和水。
   

3. 70% 乙醇

03 实验设备

1. 用于明暗箱测试的设备由一个盒子（42 x 21 x 25 厘米）组成，盒子分为一个小（三分之一）暗室和一个大（三分之二）照明室。一个 3 厘米高、4 厘米宽的受限开口连接两个腔室（如图）。
   

2. 间接白光源
   

3. 数字照度计
   

4. 摄像机（直接放置在设备上方）
   

5. 用于手动分析的数字计时器或用于自动分析的计算机

04 动物行为分析软件

• VisuTrack

• 1.系统拥有多种识别算法：智能识别法、灰度法、静态背景法、动态背景法以及高斯背景法，可自动识别动物的活动状态及睡眠状态，并可生成可视化的矢量图、运动轨迹图、热图（2D、3D）以及活动量图（2D、3D）等；

2.系统拥有完善的外部输入输出控制，将行为与生物信号（脑电图、血压、神经元活动、超声波发声）和实验刺激（声音、光、电击等）整合；
3.软件对动物形体进行全局分析，以检测鼻尖（Nose position）、前部躯体中心（Forebody Center）、身体中心（Animal Center）和尾根（Tail Base position）四个特征点，并据此分析动物行为；
4.系统可以全自动分析更多实验动物的精细行为, 如爬行/静止/原地微动,摆头/甩头,理毛修饰,转圈,支撑站立,靠边行走，嗅探，伸长，身体弯曲等，并可以生成相应时间内的动物行为图谱及节律时序图；
5.系统包含了GLP模块（GLP Module），可以实现用户权限、用户策略分配，系统自带管理员模式、审阅用户模式以及实验员模式，对应有不同的软件使用权限，并可以导出符合GLP要求的操作日志表以及审阅日志表，同时可以开展动物行为“双盲”实验；
6.同一套软件可以在同一台电脑上同一时刻在线或离线分析不同的动物行为实验，提高实验效率的同时更增加了药效评价的可靠性、实时性以及同步性，且分析结束后数据会自动按照实验类别归类；

05 实验步骤protocol

1. 该设备放置在一个隔离的房间中，远离外部干扰和噪音，使用低强度白光源。
   

2. 实验者必须注意，不能在测试过程中发出任何过大的噪音以及佩戴气味强烈的气味产品，因为它可能对小鼠产生焦虑刺激。
   

3. 光照室中的照明必须为 200-400 勒克斯或更高，而另一个室则为暗室（5 勒克斯或更低）。
   

4. 实验前将小鼠在其家笼中转移到行为测试室至少 30 分钟。
   

5. 用 70% 乙醇清洁设备的两个隔间。
   

6. 打开相机并将一只老鼠放在明亮的房间中间。
   

7. 实验者尽可能远离盒子和测试动物的视线之外。
   

8. 允许动物在两个腔室之间自由移动 5 分钟。
   

9. 每次试验后，去除所有尿液和粪便，并用 70% 乙醇清洁两个腔室。
   

10. 录制的视频可以通过VisuTrack动物行为分析软件（上海欣软）自动分析。对以下参数进行评分（图 2）：

• 进入暗室的潜伏时间。

• 在明箱和暗箱中分别花费的时间。

• 在明箱中的活动距离。

• 明暗箱进入的转换次数。

06 注意事项

• LDT 最初是由 Crawley 及其同事开发的（Crawley 和 Goodwin，1980）。原始版本和我们的测试有两个不同之处。首先，原始版本的测试持续时间为 10 分钟，而我们只使用了 5 分钟的测试时间。其次，在原始版本中，照明隔间的墙壁是透明的，而我们使用不透明的白色塑料作为墙壁。因此，与原始版本相比，我们的改进更具体地检测明亮空间焦虑，其中也对开放空间焦虑进行评分。
  

• 通常，雄性小鼠用于该行为实验，因为发情周期的变化可能会影响雌性在此类测试中的表现。
  

• 基线活动可能因小鼠品系和年龄而异。
  

• 为了保证均匀的光度，使用间接光来避免阴影的产生，这可以成为动物的选择。
  

• 在对每只动物进行测试后，必须始终清洁两个隔间，并在清洁后*干燥，因为清洁剂的强烈气味可能会改变小鼠的行为。
  

• 仅当动物将 2 个前爪和一半身体进入其中时，才考虑进入明亮或黑暗的隔间。如果动物用这两只爪子返回隔间，则不记录进入。VisuTrack软件有单独的设置动物进入区域的标准参数（可自定义）。