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试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×5 瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入4.5mL试剂二充分混匀。(3天使用完)

样品处理

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。

2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g 离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

3. 血清：直接测定。

优点如下：

1、快速简便：操作时间短，48-50T，可测40例样本左右，96-100T,可测80例样本左右；

2、取样量微：常规操作取样量50l， 酶标仪操作仅需5l即可检测，部分试剂盒取样多少请；

3、稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效；

4、再现性好：20倍稀释线性仍然良好；

5、回收试验： X =99%；

6、受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强；

7、测试面广：可测动物血清(浆)、组织、各种体液、灌流液、各种培养细胞以及细胞培养上清液等，部分试剂盒适用于检测植物。

测定步骤：

1.加样

1. 除包被外都需45度加样

2.加样体积要准确

3.管底加样，不能加在管壁上

4.加样时不能产生气泡

2.温浴

1.加标本后和加结合物后，应立即放入按规定的反应温 度的水浴箱。

2.各ELISA板不应叠在一起。

3.为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿 纱布的金属湿盒中。

4.加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。 如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便 不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。

3.洗涤

1.洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却 是决定实验成败的关键。

2.目的是洗去反应液中没有与固相抗原或 抗体结合的物质以及在反应过程中非特 异性吸附于固相载体的干扰物质。

4.读板

1.阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般 可采用目视比色。

2.如用酶标仪测定结果，准确性决定于 ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质 量和软件的算法。

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