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描述：BCA 蛋白质定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根 据目前世界上常用的蛋白浓度检测方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，该试剂盒具有蛋白 浓度测定的简单性，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。本试 剂盒的原理是蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与 Cu2+络合生成络合物，将 Cu2+还原成 Cu+，而 BCA 试剂可 敏感特异地与 Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，并在 562nm 处有最大光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质浓度 成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白的含量，1 小时内 即可完成蛋白定量检测。本试剂盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作为蛋白质标准溶液，测定范围为 25～2000 μg/ml。该 试剂盒可用于 20 次试管检测或 200 次 ELISA 板检测。

操作方法
1. 标准品的稀释：按下表将 BSA 进行稀释。
管号 PBS
BSA 体积
（来源）
BSA 终浓度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根据样品数量及测定方法，将 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按体积比 50:1充分混匀即可。
注意：配制 BCA 工作液前请将 BCA Reagent A 混匀。
3. 标准比色杯测定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各标准品和待测样品置于合适的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混匀。
(3)37℃孵育 30 min，然后室温静置 10 min。
(4)紫外分光光度计于 562 nm 处检测吸光度。
(5)绘制标准曲线。
(6)根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
4. 微管测定方法
(1)分别取 25 μl 新鲜配制的 BSA 标准液和待测样品，加入到 ELISA 反应板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混匀。
(3)37℃孵育 30 min，然后室温静置 10 min。
(4)酶标仪于 562nm 处检测吸光度。
(5)绘制标准曲线。
(6)根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
注意事项
1. 待测样品浓度在 25~2000 μg/ml 的范围内具有良好的线性关系。
2. BCA 工作液配制后 24 小时内使用效果稳定。
3. BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
4. 使用普通的分光光度计测定时，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例调整。
5. 适用范围

实例操作 按上述操作方法可得到如下标准工作曲线，该线性方程经过 多次绘制，系数均为 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之间， 重复性好，在计算蛋白浓度时可直接用该标准工作曲线进行 计算。例如：在 562 nm 处检测吸光值为 0.1，则此时 y 值 为 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白浓度为 1000 μg/ml。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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