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三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验方法

1．1．2 培养基 半合成培养基、鸡血清鸡肉汤和鸡

血清鸡肉汤琼脂。参照冯文达等［9］的方法制备。

1．1．3 试验用鸡 120只35日龄 SPF 鸡‚购自北

京实验动物中心‚在北京所负压隔离器内饲养至57

日龄。

1．2 方法

1．2．1 细菌培养 取冻干卵黄‚用普通肉汤稀释

后‚接种鸡血清鸡肉汤琼脂‚于体积分数为5％ CO2

在37℃培养24h～48h‚挑取典型菌落接种鸡血清

鸡肉汤‚在37℃培养10h～12h（B 型）和18 h～

24h（A 型和 C 型）‚分装保存于－80 ℃冰柜的同

时‚进行活菌计数和纯粹性检验［10］。

1．2．2 试验分组 将120只试验用鸡随机分成3

组‚A 型菌组40只鸡‚B 型菌组35只鸡‚C 型菌组

45只鸡（表1）。

1．2．3 攻毒 从－80℃取出纯粹性检验合格活菌

计数过的 A、B、C 型菌液‚按照保存前计数的活菌数

用半合成培养基进行稀释‚每个剂量注射5只鸡‚每

只鸡眶下窦内注射0．2mL。所含 cfu／0．2mL 如表

1。攻毒后24h 开始逐只检查每只鸡的发病情况‚

每天检查1次‚共检查7d［10］。

1．2．4 细菌分离 在攻毒后96h‚攻毒剂量最小组

（1．5×104 cfu／0．2mL）各随机取2只鸡‚进行细菌

分离［6-8］‚粗提 DNA‚进行 PCR［9‚11-12］。

2 结果

2．1 细菌培养和活菌计数

B 型副鸡禽杆菌 BJ-05株在鸡血清鸡肉汤培养

基 中培养10h 后‚菌液浑浊‚计数结果为10×

108cfu／mL；A 型副鸡禽杆菌 C-Hpg8（CVCC254）在

鸡血清鸡肉汤培养基中培养24h 后‚可见细菌明显

生长‚计数结果为0．2×108cfu／mL；668株在鸡血清

鸡肉汤培养基中培养20h 后‚菌液较浑浊‚计数结

果为4×108cfu／mL。纯检结果均未发现有其他细

菌生长。

2．2 攻毒鸡只发病情况

攻毒后24h～168h‚每天逐只检查鸡只的发病

情况。攻毒后24h‚3大组鸡只大部分发病‚表现为

眶下窦肿胀‚流鼻汁、有少数鸡只面部水肿。攻毒后

48h‚除 A 型3．0×104cfu／0．2mL 组和 B 型100×

104cfu／0．2mL 组各有1只鸡没有发病外‚其余118

只鸡均发病‚且大部分鸡只呈现明显的鸡传染性鼻

炎临床症状‚眶下窦明显肿胀‚鼻孔周围黏附饲料‚

面部水肿明显‚公鸡肉垂水肿。攻毒后72 h‚A 型

3．0×104cfu／0．2mL 组的5只鸡全部发病‚其余基

本与攻毒后48h 相同。攻毒后第4天至第5天‚发

病鸡数和临床症状与攻毒后72h 相同。至第6天‚

部分发病鸡只临床症状减轻至消失‚攻毒后第7天‚

除少数鸡只外‚大部分鸡只临床症状消失。攻毒后

24h～72h 的详细发病情况见表2。表2中的“＃”

眶下窦肿胀明显‚面部水肿‚鼻汁多‚有的鸡只眼睛

一过性失明‚公鸡肉垂水肿。“＋＋＋”表示眶下窦

肿胀较明显‚鼻汁较多；“＋＋”表示眶下窦肿胀‚有

鼻汁；“＋”表示用手挤压时流出鼻汁。

2．3 细菌分离和 PCR 鉴定

从 A 型、B 型和 C 型各2只鸡的眶下窦均分离

到纯的副鸡禽杆菌‚将它们接种普通肉汤和普通琼

脂‚37℃培养96h‚均未见细菌生长。用6个分离株

的粗提 DNA 进行 PCR‚结果6／6阳性‚与标准阳性

对照大小（0．5kb）一致（图1）

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