表 1. 片段化 / 末端修复 /dA 尾反应体系

3. 吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 按下表设置反应程序(热盖设置为 82℃)  ，将上述 PCR 管置于 PCR 仪中反应。

表 2. 片段化 / 末端修复 / 加 dA 尾反应程序

 接头连接(Adapter Ligation)
1. 将所需试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 如下表所示配制反应体系。

表 3. 接头连接反应体系(接头详细说明见注意事项 二)

3、吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4、将上述 PCR 管置于 PCR 仪中 22℃，孵育 60min。
【注】：当投入 DNA 量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长。

连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
A. 产物纯化操作步骤(必选)
1、准备工作：将 AMPure XP Beads 室温平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、吸取 48 μL AMPure XP Beads   (1 .2×，Beads:DNA=1.2:1)  至接头连接产物中，  涡旋混 匀或移液器吹打 10 次混匀，室温孵育 5 min。
3、短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后(约 5 min)，弃上清。
4、保持 PCR 管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，弃上清。
5、重复步骤 4。
6、保持 PCR 管始终置于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚出现龟裂(约 5 min)*。
7、   
1)  如产物无需进行片段分选，将 PCR 管从磁力架中取出，磁珠 ( 无需用水洗脱 ) 直接用于文库扩增步骤反应。

2)  如产物需进行双轮分选，  加入 52-102 μL Nuclease-free Water，涡旋振荡或轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清 后(约 5 min)  ，小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中，切勿触碰磁珠(洗脱体积越大，洗脱效率越高，分选效果越好，详细说明见注意事项）。
* 等待磁珠干燥过程中，可配制 文库扩增步骤反应体系。


B. 双轮分选操作步骤(可选)
1、准备工作：将 AMPure XP Beads 室温平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、根据 DNA 片段长度要求，参考表 4 向纯化产物中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液 器吹打 10 次混匀。

表 4 文库双筛对应磁珠体积参照表

【注】：表中“0.7×”表示样品 DNA 体积的 0.7 倍。如文库插入片段长度为 200 bp，样品 DNA 体积为 100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为 0.70×100 μL=70 μL；第二轮分选磁珠使用体积为 0.25×100 μL=25 μL。

3、室温孵育 5min。将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后(约 5 min)  ，小 心转移上清到干净的 PCR 管中。
4、参考表 4 向上清中加入第二轮分选磁珠。涡旋混匀或移液器吹打 10 次混匀，室温静置 5 min。
5、 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后(约 5 min)，弃上清。
6、保持 PCR 管始终处于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，弃上清。
7、重复步骤 6。
8、保持 PCR 管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚出现龟裂(约 5 min)*。
9、将 PCR 管从磁力架中取出，磁珠 ( 无需用水洗脱 ) 直接用于文库扩增实验。
* 等待磁珠干燥过程中，可配制 文库扩增步骤反应体系。


文库扩增(Library Amplification)
1、将表 5 所需试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2、如下表所示配制反应体系。

表 5 文库扩增反应体系 

【注】：  含有 Index 的 PCR 引物(i5 Prmier 和 i7 Primer)  信息详见 MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)说明。

3、将配置好的 PCR 反应液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步骤完成后的含有磁珠的 PCR 管中，  吹打或 振荡混匀，并短暂离心。
4、按下表设置反应程序，将上述 PCR 管置于 PCR 仪中反应。

表 6 PCR 扩增反应程序

产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)
同：产物纯化操作步骤。使用 AMPure XP Beads(1×，Beads:DNA=1:1)  纯化文库扩增产物，  最后加适量 Nuclease-free water(20-50 μL)  进行洗脱(产物如需保存请 使用 TE Buffer 洗脱)。

文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见：注意事项中的关于文库质检。

注意事项
关于操作
1、请穿实验服并戴一次性手套进行实验。
2、使用前请将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3、混匀时请轻轻吹打或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4、为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的一次性枪头。
5、推荐在带热盖的 PCR 仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR 仪至反应温度附近。
6、请在洁净的实验环境下实验，避免污染。

TLX Adapter for ILM 说明
1、TLX Adapter for ILM 采用短接头模式。
2、接头浓度：15 μM; 直接用于相应建库试剂盒连接体系里即可。
3、-20℃保存，使用前提前融化，尽量低温融化，避免在超过 30℃的环境中融化。
4、建库推荐使用量：常规 DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns；其他 DNA 投入量需要适当调 整接头使用量。

关于磁珠纯化与分选
1、DNA 片段选择步骤可在接头连接后或文库扩增后进行。
2、当 Input DNA 质量≥ 50 ng，  建议在接头连接后分选；  如 Input DNA 质量<50 ng，  可在 文库扩增后进行分选。
3、TLX Ligase Buffer 包含高浓度的 PEG，对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，当在接头 连接后进行片段选择，须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在文库扩增后进行片 段选择，可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4、磁珠使用前应先平衡至室温，并混匀再使用，否则会导致得率下降。
5、80% 乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6、进行片段选择时， 初始样品体积应尽量≥ 100 μL， 初始样本体积越大， 片段选择效果越好。

关于文库扩增
1、文库扩增循环数与文库产量和文库质量有直接关系，请参照下表列举的本试剂盒设置扩增 循环数，并摸索合适的循环数。

表 1. 文库扩增循环数参照表

【注】：如文库扩增后需要做片段选择时参照较高循环数扩增。

关于文库质检
1、通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2、文库浓度检测可使用：基于双链 DNA 荧光染料的方法， 如 Qubit® 或 qPCR 绝对定量的方法。
3、文库长度分布检测，可通过 Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛细管电泳或微控流原理的 设备进行检测。

运输与保存方法

 -20℃运输。
所有组分 -20° C 保存，有效期 1 年。

MICH TLX DNA建库试剂盒产品信息