1.            质粒构建

流程：

1. 目的基因的PCR扩增

2. PCR产物纯化

3. 载体和PCR产物进行双酶切

4. 胶回收

5. 载体与目的基因的连接

6. 转化

7. 菌落PCR鉴定

8. 重组质粒的抽提

2.            基因打靶（gene targeting）

基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。它的产生和发展建立在胚胎干(ES) 细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引人、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。建立在胚胎干细胞与同源重组的基础之上。是一种定向改变生物遗传信息的实验手段。

实验原理：首先获得ES（胚胎干细胞） 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。

基因打靶的方式：全基因打靶、条件性打靶、诱导性打靶、组织特异性打靶和基因捕获打靶等。

主要步骤：

1. 打靶载体的构建

2. 导入：显微注射法（常用），电穿孔法，逆转录病毒载体法等；受体细胞一般采用胚胎干细胞（ES）

3. 筛选: (G418和GANC培养基)

a) 正负选择系统（G418R/GANCR）

b) 正向选择法

4. PCR进一步鉴定

5. 打靶ES细胞导入囊胚

6. 囊胚植入假孕母鼠子宫发育