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His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)
His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)
产品货号:26421(5ml)
产品简介:
His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂(细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分),使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力,能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点,较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+ 更为牢固,有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力,提高纯化效率。较高的基团密度,大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下,对来源于各种表达系统(如杆状病毒,哺乳细胞,酵母以及细菌)中的His标签蛋白,均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子,可直接用可溶性蛋白的纯化,使用方便,快捷。
支持物: CL-6B琼脂糖凝胶
载量: 20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径: 50-160 µm
产品内容:
产品名称 | 包装 | 储存条件 |
Ni-Agarose Resin | 5 ml | 2-8℃,避免冷冻 |
Bacterial Protein Extraction Reagent | 65 ml | 室温 |
1 M Tris-HCl(pH7.9) | 15 ml | 室温 |
1 M Imidazole | 65 ml | 室温 |
3 M NaCl | 120 ml | 室温 |
Protease Inhibitor Cocktail | 700 µl | -20℃ |
Affinity Column (12 ml) | 1 set | 室温 |
操作步骤:
Ⅰ缓冲液的准备
可溶性蛋白纯化缓冲液配方:
Component | Tris-HCl(pH7.9) | Imidazole | NaCl |
Soluble Binding Buffer | 20mM | 10mM | 0.5 M |
Soluble Elution Buffer | 20mM | 500mM | 0.5 M |
Ⅱ组装层析柱
1. 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱,室温静置10分钟,待凝胶与溶液分层后, 把底部的出液口打开,让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意:
1)填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋 白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)如果乙醇不流出,可以给柱子一个外力,例如用大拇指对柱口轻轻按压一下,迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2. 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后,再用10倍柱体积的 Binding Buffer平衡柱子,平衡结束后即可上样。
注意:柱体积指的是填料的体积。
Ⅲ可溶性蛋白的纯化
1. 收集菌体后,每100 mg菌体(湿重)加入1-5 ml细菌裂解液(每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物),超声裂解菌体。
注意:
1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时,建议加入DNase I和Lysozyme。每1 ml 细菌抽提试剂中加入1 μl DNase I(1,000 U/ml),2 μl Lysozyme(50 mg/ml)。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中,超声条件依赖于所使用的超声仪功率,探头种类,容器的大小形状,需实验中自己摸索,应避免连续超声导致的大量产热,可分成短时间,多次超声,通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
2. 10000 rpm,4℃离心3分钟,收集上清中的可溶性蛋白。
3. 用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱,流速为10倍柱体积/小时,收集流穿液。
注意:
1)本试剂盒中附带有一块筛板,使用时先将筛板加至填料的上层,该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤,防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱,但是筛板放入柱子后就不易取出。
2)通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
4. 使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白。
5. 使用适量Soluble Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。
注意:洗脱峰可以分管收集,每1 ml收集1管,并采用蛋白监测仪监测,收集洗脱峰
6. 洗脱后,依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),封柱后2-8℃保存。
注意:如果是分段梯度洗脱,最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时,则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后,再进行第6步的操作
Ⅳ柱再生
当填料使用多次后,结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色), 可以用以下方法再生,提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1. 使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后,使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2. 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
3. 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗,再依次使用1倍柱体积的75%、
50%和25%的乙醇冲洗。
4. 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5. 使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6. 使用3倍柱体积去离子水,3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7. 2-8°C保存。
8. 再次使用前,需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗,然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生,3个柱体积的Binding Buffer平衡。
注意事项:
1. 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性,本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化。
2. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
3. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4. 为提高纯化效率,首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度,Binding Buffer的范围为0-10 mM,洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
5. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液,并通过0.22µm或者0.45µm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞,建议将裂解液进行离心,或者使用0.22µm或者0.45µm过滤器过滤。
6. 柱再生时,保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。