Cell Counting Kit-8

 Catalog Number：P11110

01/产品概述

       LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110，简称CCK-8或CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒，是MTT、XTT、MTS等的优良替代方法。

　　WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(图1)。对于相同起始量的细胞，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同种细胞，颜色的深浅(生成的formazan量)与细胞数目呈线性关系(图3)。

图1.WST-8检测原理图（EC=electroncouplingreagent，即电子耦合试剂）

    　WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有以下明显的优点：

　　(1)MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液来溶解，而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。

　　(2)WST-8比XTT、MTS更加稳定，使实验结果更加可靠。

　　(3)WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

　　LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110为即用型试剂，使用方法十分便捷，无须再进行任何配制等操作，无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内即可完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤溶解formazan，可以用于大批量样品的检测。同时，WST-8对细胞无明显毒性，加入CCK-8溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。LeapWalCellCountingKit-8CCK-8可以应用于细胞增殖和细胞生长抑制检测、毒性测定、药物筛选、肿瘤药敏等试验。

02/产品组分

03/保存条件

       冰袋（wetice）运输。4℃避光保存，有效期12个月。-20℃避光保存，有效期24个月。

04/产品特点

　　即用型试剂，无须再进行任何试剂的配制

　　对细胞无明显毒性，检测时间更加灵活，可在不同时间点反复/连续读值

　　显色稳定，使实验结果更加可靠

　　线性范围宽，灵敏度高

　　可用于大批量样品的检测

05/实验流程概要

06/实验步骤

一.制作标准曲线（使用此标准曲线的前提条件是试验条件*一致）

　　1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液的细胞数量，然后接种细胞；

　　2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般需要做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔；

　　3.接种后培养4-6小时使细胞贴壁（悬浮细胞可省略此步骤）；

　　4.加入LeapWal Cell Counting Kit-8试剂（每100μL培养基加10μLCCK-8）。培养一定时间（0.5-4小时）后测定OD450，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD450为纵坐标的标准曲线，根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。

二.细胞活性检测

　　1.在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养16-24小时；

　　2.向每孔中加入10μLCCK-8溶液，切勿产生气泡，气泡会影响OD值的读数；

　　3.将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时；

　　4.用酶标仪测定450nm处的吸光度。

三.细胞增殖-毒性检测

　　1.在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养16-24小时；

　　2.向培养板加入不同浓度的待测药物（依据实验者具体方案而定）；

　　3.将培养板置于培养箱内孵育一段时间（依据实验者具体方案而定）；

　　4.向每孔加入10μLCCK-8溶液，切勿产生气泡，气泡会影响OD值的读数；

　　5.将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时；

　　6.用酶标仪测定450nm处的吸光度。

　　Ø如果待测物质有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前，弃去旧培养基，用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基，来去除药物的影响。当药物影响较小时，也可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白对照孔的吸光度值即可。

07/计算公式

　　细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

　　抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

　　As:实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液）

　　Ac:对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物）

　　Ab:空白孔吸光度（含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物）

08/适用范围

　　1.细胞增殖测定：CCK-8是水溶性的，在培养基中稳定且无毒。

　　2.细胞活性和细胞毒性分析：代谢活性以及染料的形成与细胞的活性和损伤成比例。

　　3.细胞因子分析：测定细胞因子诱导的增殖，必要时，可在试验结束时回收和扩增细胞。

09/注意事项

　　1.使用96孔板进行检测时，需考虑液体蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发，建议弃用周围一圈，改加等量的PBS、水或培养液。

　　2.细胞增殖实验建议每孔加入100μL2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μL5000个细胞（具体每孔所用的细胞数目，需根据细胞大小、细胞增殖速度等因素决定）。按照实验需要进行培养并给予0-10μL特定的药物刺激。

　　3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，还原剂（例如，抗氧化剂）会干扰检测结果，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

　　4.测试药物如含有金属，对CCK-8显色会有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%，15%，90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM，将会100%抑制，需设法去除。

　　5.培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

　　6.检测时，如果起始培养体积为100μL，每孔加入10μLCCK-8溶液。如果起始培养体积为200μL，则需加入20μLCCK-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

　　7.CCK-8的培养时间一般为0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时即可。孵育时间的长短需根据细胞类型和细胞密度等实验情况而定，需要摸索条件，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的时间点用于后续实验。

　　8.在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

　　9.酶标仪检测前需确保孔内没有气泡，否则会干扰测定结果。

　　10.需要测定细胞的具体数量时，建议同时做标准曲线。

　　11.若检测样本较多，建议采用多通道移液器，以减小工作量及平行孔间的差异。

　　12.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板):(a)显色反应后，将培养板放置于4℃冰箱内。(b)每孔加入10μL0.1MHCl溶液。(c)每孔加入10μL1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意：反应停止后，应在24小时内测定。

　　13.为了您的健康安全，请规范操作，穿戴实验服与手套开展实验。

　　14.本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及治疗。

10/实验案例分析

　　1.将不同数量的HeLa细胞按照每孔100μL培养液接种于96孔板中，培养24小时后细胞充分贴壁，每孔加入10μLCCK-8溶液。

　　2.孵育1小时后测定450nm的吸光度值，检测结果如图3所示。（检测结果仅供参考，实测数据会因检测仪器等的不同而存在差异）

图3: CCK-8 试剂盒检测细胞活性