解乏、补充营养、改善睡眠......对它的检测很关键！

前言

色氨酸（Tryptophan），又称β-吲哚基丙氨酸，是一种有机化合物，化学式C₁₁H₁₁N₂O₂，是人体的必需氨基酸之一。色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质，其结构与IAA相似，在高等植物中普遍存在，也是人体中重要的神经递质—5-羟色胺的前体，可用于妊娠期妇女营养补充剂和乳幼儿的特殊奶粉，用于烟酸缺乏症，作为安神药，可调节精神节律，改善睡眠，也是复方氨基酸大输液的原料之一。

关键词：液相色谱；荧光检测器；食品；L-色氨酸；内标法。

1.实验方法

1.1 仪器配置

表1高效液相色谱系统配置清单

1.2 测试条件

色谱柱：Nova Atom PC18, 4.6×150mm，3μm；

柱温：35℃；

流速：0.8ml/min；

流动相：A/B=甲醇/0.01mol/L乙酸铵；

进样量：10μL；

表2 流动相梯度洗脱表

1.3 试剂及实验材料

甲醇：色谱纯，

乙酸：色谱纯，

乙酸铵：色谱纯，

无水氢氧化锂:电子级；

盐酸：优级纯；

标准物质：L-色氨酸（CAS号：73-22-3）；

内标物：1-甲基-D-色氨酸（CAS号：110117-83-4）；分析天平；

超声脱气装置；

滤膜：0.45μm，0.22μm。

1.4 标样制备

1.4.1 L-色氨酸标准储备液（1.00mg/mL）

准确称取25mg(精确至0.0001g）L-色氨酸标准品，于25mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1.00mg/mL的标准溶液。转移至棕色玻璃容器中，于4℃冰箱中保存。保存期6个月。

1.4.2 L-色氨酸标准中间液(100μg/mL)

吸取L-色氨酸标准储备液 1.00mL 于 10mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。转移至棕色玻璃容器中,于4℃冰箱中保存,保存期6个月。

1.4.3 内标工作液(1 mg/mL)

称取 10 mg(精确至 0.001g)1-甲基-D-色氨酸标准品于10 mL,容量瓶中,用水溶解后定容至刻度,混匀。转移至棕色玻璃容器中,于4 ℃冰箱中保存,保存期6个月。

1.4.4 L-色氨酸标准系列工作液

分别移取L-色氨酸标准中间液 2.0μL、10μL、50μ L、100μL、200μL、500μL于1mL容量瓶中,各加入 100μL内标工作液,加水定容至刻度,混匀。L-色氨酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.20μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL。临用现配。

2 结果与讨论

2.1 单标定性

取L-色氨酸标准使用液10.0μg/mL和内标使用液100 μg/mL按照1.2测试条件分别进样，记录进样时间和谱图（图1-2）。

图1  L-色氨酸（10.0μg/mL）单标谱图

图2 内标（100μg/mL）单标谱图

单标谱图数据 

说明：由图可知目标峰附近无杂质干扰。理论塔板数为9577，符合实验要求。

2.2 标准曲线

L-色氨酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.20μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL，按照1.2的测试条件进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用内标法建立工作曲线。结果如图3所示。

图3  L-色氨酸校准曲线线性图

说明：由数据可得，L-色氨酸在0.2-50.0μg/mL浓度范围内曲线方程为y=0.75435*x+0.00231，R平方值≥0.9999，具有良好线性符合实验要求。

2.3 重复性试验

取浓度10.0μg/mL 的L-色氨酸，内标浓度100μg/mL的标准工作液，按照1.2的测试条件分别连续进样测定7次，重复性色谱图如图5所示。

图4  L-色氨酸标准品(10.0μg/mL )重复性叠加谱图(n=7)

谱图数据

说明：由数据可得，浓度（10.0μg/mL）的L-色氨酸和浓度100μg/mL的1-甲基-D-色氨酸保留时间重复性小于0.15%，峰面积重复性小于0.55%，测试重复性良好，说明皖仪LC3200系列高效液相色谱仪具有良好的精密度。

2.4 检出限实验

取浓度0.20μg/mL 的L-色氨酸，内标浓度100μg/mL的标准工作液，按照1.2的测试条件进样测定，记录谱图如图4。

图5  0.20μg/mL 的L-色氨酸谱图

说明：由数据可得，L-色氨酸的仪器检出限为0.002μg/mL，定量限为0.007 μg/mL。符合实验要求。

2.5 样品实验

准确称取试样 0.2 g(精确到 0.001g)于 10ml,螺纹带盖的聚四氟乙烯水解管中,依次加人 0.5 ml 内标品溶液、5.0ml氢氧化锂溶液,涡旋混匀后超声溶解,于 110 ℃恒温箱中水解 20h。取出水解管,冷却至室温,用3mol/L盐酸调pH至6-8,用水将样品转移并定容至 50mL,容量瓶中，混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤,滤液供液相色谱测定。

空白样品谱图如图6，样品谱图如图7

图6 某奶粉空白样品谱图

图7 样品谱图

谱图数据

说明：由数据以及标准中的公式计算，样品含量为2650mg/100g。

2.6 注意事项

1.配制流动相0.01mol/L乙酸铵时需先调节pH，再定容。

2.内标物质用水溶解较慢，可用超声加速溶解。

3 结论

本文使用皖仪LC3200系列高效液相色谱仪对标准品L-色氨酸进行了检测，实验结果表明L-色氨酸在浓度在0.2-50.0μg/mL浓度范围内具有良好线性关系，线性相关系数大于0.9999，L-色氨酸连续进样7次的保留时间重复性小于0.2%，峰面积重复性小于0.6%，测试重复性良好。仪器检出限为0.002μg/mL，定量限为0.007μg/mL。该方法准确可靠、灵敏度高，可用于婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品和婴幼儿谷类辅助食品中色氨酸的测定。