GFP-Nanoab-Magnetic Beads

货号：GNM-25-1000/GNM-50-2000

储存条件：可在 4℃保存半年，避免离心，干燥，长时间保存可冻存。

产品描述

偶联 anti-GFP 纳米抗体的磁性纳米微球用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。

产品优势

没有普通抗体的轻链和重链；

高亲和力：解离常数达到 pM 级别；

高载量：20μl 的 slurry 可以结合 8-10μg GFP 蛋白；

较短的孵育时间，结合 5-30 min 即可；

应用范围

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；

特异性

可以结合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等。

产品特性

保存条件：可在 4℃保存半年，避免离心，干燥，长时间保存可冻存。

存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。

实验步骤：

收集细胞：

每个免疫沉淀反应大约使用 10⁶-10⁷ 的哺乳动物细胞（约一个 10 cm培养皿）表达绿色荧光蛋白融合蛋白。吸出生长培养基、向培养皿中加入 2ml预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或yi酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g离心 3 分钟并丢弃上清液。

植物组织裂解处理：

取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨，尽 可能充分研磨破坏其细胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制剂 PMSF 等）进行裂解，为了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震荡 30min，裂解完成后 12000 rpm，离心 30min，吸取上清 置新的离心管中，弃去沉淀。

细胞裂解：

1．用500μl 预冷的裂解缓冲液重悬细胞，在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF（自备）。对于核/染色质蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2，蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF（自备）。

2．把离心管放置在冰上 30 分钟，可以每 10 分钟充分吹打一次。

3．细胞裂解产物在 4℃，20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子：

4．振荡混匀 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，吸取 40μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。（此步骤可选）

结合蛋白

5．将细胞裂解产物加入到平衡的 GFP-Nanoab-Magnetic Beads 中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入40μl slurry），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 30-60 min。如果需要，保存 50 μl 的裂解产物进行免疫印迹分析。

6. 在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。如果需要，保存 50 μl 上清液进行免疫印迹分析。

清洗珠子：

7. 用 500 μl 预冷的裂解缓冲液中重悬 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。（可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。

洗脱蛋白：

方法一：

加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 GFP-Nanoab-Magnetic Beads。

在 95℃，10 min 条件下，加热 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来。GFP-Nanoab-Magnetic Beads 可在磁力架上进行分离，收集的产物可以进行 SDS–PAGE 分析。

方法二：

替代步骤 8 和 9 的可选步骤：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘an酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后用磁力架进行分离，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘an酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

可选方案

方案一：

如需进行 GFP 融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。

方案二：

如需进行染色质免疫沉淀（ChIP） 实验，主要用于含有 GFP 融合蛋白的蛋白质/DNA 相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化以及 DNA 的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第 5 步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到 GFP-Nanoab-Magnetic Beads上；进入第 6 和 7 步，分离得到复合物；进入第 10 步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA 的纯化及 DNA 的鉴定等同于普通的 ChIP 实验。RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。

方案三：

GFP-Nanoab-Magnetic Beads 不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用，也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行 SDS–PAGE 分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。