DYKDDDDK-Nanoab-Agarose

货号：FNA-25-500   FNA-50-1000

保存条件：4℃一年；-80℃长期保存，避免反复冻融

产品描述：

偶联anti-DYKDDDDK-tag纳米抗体的琼脂糖珠子用于免疫沉淀DYKDDDDK-tag (DYKDDDDK)融合蛋白。

产品优势：

没有普通抗体的轻链和重链；

即用型，节约时间；

高亲和力，高载量;

应用范围：

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；

特异性

特异性结合DYKDDDDK-tag。

产品特性：

存储缓冲液：PBS(含有20%乙醇)。

保存条件：可在4℃保存1年(确保wan全密封)，或在-80℃长期保存，避免反复冻融。

实验步骤：

收集细胞
每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 个表达DYKDDDDK-tag融合蛋白的细胞，可根据DYKDDDDK-tag融合蛋白表达量适当调整细胞数。吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或yi酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g离心3min并丢弃上清液。

植物组织裂解处理：

取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制剂 PMSF 等）进行裂解，为了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震荡 30min，裂解完成后 12000 rpm，离心 30min，吸取上清 置新的离心管中，弃去沉淀。

细胞裂解
1．在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用500μl预冷的裂解缓冲液重悬细胞。

2．置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次。
3．4℃，20,000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。

注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。

结合蛋白
4．将20μl平衡好的DYKDDDDK -Nanoab-Agarose加入到细胞裂解产物中（可在细胞裂解产物中直接加入20μl该产品），于4℃旋转混合结合1小时。根据实验需要可调整结合时间。如果需要，留存50μl的裂解产物进行免疫印迹分析。

5．4℃，2,500g离心30秒，丢弃上清液。如果需要，留存50μl上清液进行免疫印迹分析。

清洗珠子
6．用500μl预冷的裂解缓冲液中重悬5中的DYKDDDDK -Nanoab-Agarose，4℃，2,500g条件下离心30秒，丢弃上清液并重复洗涤3次。尽量减少清洗时间。

洗脱蛋白
方法一：
7. 加入20μl 2×SDS-sample buffer重悬DYKDDDDK -Nanoab-Agarose。95℃，加热10min充分变性，2,500g离心30秒收集上清，收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。
方法二：
8. 替代步骤7的可选步骤：加入50μl 0.2M pH2.5的gan氨酸洗脱结合的蛋白，孵育时间30秒，期间不断混匀，2,500g离心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸。如果洗脱的蛋白含量少，可尝试用2×DYKDDDDK-tag进行亲和纯化。

注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

可选方案：
方案一：
如需进行DYKDDDDK融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。
方案二：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，主要用于含有DYKDDDDK融合蛋白的蛋白质/DNA相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，联反应的逆转，DNA的纯化以及DNA的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第4步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到DYKDDDDK -Nanoab-Agarose上；
进入第5和6步，分离得到复合物；进入第8步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA的纯化及DNA的鉴定等同于普通的ChIP实验。RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。
方案三：
DYKDDDDK-Nanoab-Agarose 不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用，也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行SDS–PAGE分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。