Protein A+G agarose

货号：P0233

储存条件：4℃保存，有效期一年。请勿冷冻。

产品描述

Protein A+G Agarose主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。

Protein A是一种发现于jin黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白，分子量为42kDa；Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶(agarose)以一定的方式结合，可用于免疫沉淀或抗体的纯化。

Protein A+G Agarose适合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose单独可以免疫沉淀的抗体，包括human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c，rabbit IgG，rabbit、goat多克隆抗体。

本产品中的Protein A和Protein G共价连接到4%的高交联度、高流速琼脂糖上，并按1:1比例混合。每mlProtein A+G agarose beads (沉淀物)可以结合超过40mg human IgG。本产品中agarose beads的平均直径为45-165μm，抗体纯化时的推荐线性流速为50-300cm/h，耐压指数最高为0.1MPa。  

本Protein A+G Agarose 如果用于常规的免疫沉淀，每ml本产品可以免疫沉淀50次。

注意事项

1. 请勿冷冻保存本产品。

2. Protein A+G Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。

3. 本产品含有微量的防腐剂，不会影响常规的免疫沉淀和抗体纯化。但如果后续涉及酶活性测定，使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤Protein A+G agarose beads三次，以充分消除防腐剂可能产生的干扰。

4. 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4度或冰上操作。

5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

a. 蛋白样品的准备：

(a) 对于10cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500ul至2ml细胞裂解液裂解细胞。可以使用LABLEAD生产的Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。

(b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

(c) 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10cm培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

b. 去除非特异性结合(可选做)：

(a) 取200ul至1ml蛋白样品，蛋白量约为200ug至1mg，加入约1ug和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG 和20ul充分重悬的Protein A+G Agarose，4ºC缓慢摇动30min至2h。

(b) 2500rpm(约1000g)离心5min，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：所谓种属相同的IgG是指后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG，可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

c. 免疫沉淀：

(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗，4ºC缓慢摇动过夜。

(b) 再加入20ul充分重悬的Protein A+G Agarose，4ºC缓慢摇动1-3h(为方便后续的洗涤操作，可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40ul)。

(c) 2500rpm(约1000g)离心5min，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。

(d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1ml。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同步骤(c)。

(e) 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40ul 1X SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

(f) 100ºC或沸水浴处理3-5min，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20ºC保存。

2. 免疫共沉淀：

参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻

存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

3. 抗体纯化：

a. 准备工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔径的滤膜过滤所用的溶液。

(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。

(c) 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A+G Agarose装填纯化柱。也可使用LABLEAD的预装柱产品。

(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵，也可以完quan依靠重力洗涤并平衡纯化柱。

b. 抗体纯化：

(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。

(b) 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完quan可以通过测定280nm的吸光度进行确定。

(c) 洗涤完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A+G的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。

c. 纯化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。 (b) 用TBS来保存再生的纯化柱。