hESC细胞培养教程之：hESC细胞复苏

一.准备工作

1. 将恒温水浴锅调至37℃预热，提前30 min将DMEM/F12培养基，Immocell hESC专用培养基，Immocell Y-27632（10 mM） 和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中，恢复至室温；

2. 取15 mL离心管，并做上标记；吸取10 mL DMEM/F12 培养基加到离心管中；

3. 取15 mL离心管，并做上标记；吸取4 mL Immocell hESC专用培养基加到离心管中；按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632（10 mM），充分混匀，恢复至室温；

注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基

二.hESC细胞复苏

1.从液氮罐中取出待复苏的细胞，转移置于干冰泡沫箱中，取出一支待复苏的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将消失时取出；75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，放入生物安全柜；

2.将细胞悬液移至15 mL离心管中，随后逐滴缓慢加入10 mL DMEM/F12，轻柔晃动混匀细胞，160 g离心5 min；

3.离心完后可看到离心管底部有细胞沉淀，将离心好的细胞置于生物安全柜中，吸弃上清，尽量吸尽，但是注意不要吸起细胞沉淀，加入预温的4 mL Y-27632+hESC专用培养基，重悬细胞沉淀，混匀细胞，尽量避免反复吹打，以免细胞团被吹散成单细胞；

4.吸弃预包被6孔板中2孔的Matrigel包被液；将混匀的细胞按照2 mL/孔接种到2孔中；

5.将新接种的细胞在6孔板做上标记，水平十字摇匀三次；显微镜下50%细胞呈4-10个聚集的团块，密度为10%-20%；

6.将培养皿置于37℃ 5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中;再次水平十字摇匀三次，培养18-24小时后，观察到细胞贴壁良好；

7.更换新鲜的hESC专用培养基，之后每天更换；

hESC细胞复苏注意事项

1.培养基一定恢复室温；

2.细胞解冻时应在冰晶未消失时及时取出，不能等到细胞融化；

3.离心完的细胞沉淀重悬不可反复吹打；

4.离心后的细胞沉淀会出现不容易吹不散的情况，在吸弃上清液可剩余10-15 μl，用手指轻弹离心管底部，使细胞均匀分散。