一.冻存条件

1.显微下观察细胞状态良好，细胞汇合度达85%左右可以收获冻存，一般6孔板可收集2-4x106个活细胞/孔，可冻存一管；

二.准备工作

1.准备相应数量的2 mL冻存管;标记细胞名称，代次，日期，操作人；

2.提前从4℃冰箱中取出Immocell hESC冻存液，置于室温预温，提前将梯度程序降温盒置于4℃冰箱中预冷；

三.hESC细胞冻存步骤

1. 从培养箱中取出待冻存细胞，吸弃皿中的hESC培养基，加入2 mL/孔的DPBS，再吸弃;加入2 mL/孔的Immocell EDTA传代工作液（0.5 mM）, 使溶液覆盖孔底，将培养板置于细胞培养箱中；

2. 注意：保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触了，使其受热均匀，不要叠放，设定消化时间10 min；

3. 消化结束后，从培养箱中取出消化的细胞，显微镜下观察细胞变化，大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；

4. 将消化好的细胞培养板拿回生物安全柜中，避免震荡摇晃细胞，倾斜吸弃Immocell EDTA传代工作液，摇匀预温的Immocell hESC冻存液，每孔加入1mL冻存液,轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中；

注意：Immocell hESC冻存液中的DMSO易沉积在溶液下部，如未摇匀可能造成开始用时DMSO浓度不够，后面用的DMSO浓度过高，造成冻存细胞的不稳定，将冻存细胞置于梯度程序降温盒中，置于-80℃过夜，次日转入液氮罐中长期保存，或使用程控降温设备将细胞降至-80℃以下后，直接转入液氮储存。