LDH 细胞毒性检测试剂盒简介

由于细胞死亡或膜损伤而导致的细胞膜完整性丧失导致某些可溶性胞质酶的释放。因此，可以通过测量释放到培养物上清液中的这些酶的活性来测量急性细胞毒性。乳酸脱水酶（LDH）是一种稳定的酶，存在于所有细胞类型中，并在质膜受损时迅速释放到细胞培养基中。因此，LDH是细胞毒性研究中使用最*泛的标志物。

LDH氧化乳酸生成NADH，然后与某些染料反应生成黄色。生成的颜色的强度与裂解的细胞数直接相关，这表明细胞毒性。LDH活性可以通过分光光度计或酶标仪在490nm处轻松量化。

LDH 细胞毒性检测试剂盒使用方法

1.预实验—确定 LDH 细胞毒性测定的最*细胞数： 

1.1 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞； 

1.2 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔； 

1.3 接种后培养 2-4 h 使细胞贴壁； 

1.4 在高对照孔和高对照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution，在低对照孔中加入 10 μL 培养基，37℃ CO 培养箱内培养 30 min； 

1.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培养基上清，以剩余培养基及细胞作为检测对象，向每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀。 

1.5间接法：从每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀。 

1.5 注：直接法适用于不需要收集活细胞进行其它实验，间接法适用于需要收集活细胞进行其它实验。根据实验目的选择其中一种方法测定 LDH 活性。 

1.6 室温避光孵育 30 min,1.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后，立即用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。 

2.5 注：根据如下要求选择最*的细胞浓度： 

2.5 a. 高对照孔和低对照孔的 OD 值之差 > 0.2； 

2.5 b. 在线性曲线上的该细胞浓度的 OD 值 < 2.0。 

2. 细胞毒性检测： 

2.1 在 96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养 24 h； 

2.2 向培养板加入不同浓度的待测药物； 

2.3 将培养板在培养箱孵育适当时间； 

2.4 在高对照孔和高对照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution，在低对照孔中加入 10 μL 培养基，37℃ CO 培养箱内培养 30 min； 

2.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培养基上清，以剩余培养基及细胞作为检测对象，向每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀； 

2.5 间接法：从每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀； 

2.5 注：直接法适用于不需要收集活细胞进行其它实验，间接法适用于需要收集活细胞进行其它实验。根据实验目的选择其中一种方法测定 LDH 活性。 

2.6 室温避光孵育 30 min；2.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后，立即用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。 

2.5 注：配合使用 CCK-8可获得死细胞和活细胞数据。

注意事项及储存

1. 用酶标仪检测前需确保每孔内没有气泡，否则会干扰测定。 

2. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。 

3. 由于血清含有乳酸脱氢酶，建议血清的使用浓度不要超过 1%，并最*使用热灭活血清。如果一定需要使用10% 血清，在检测时一定要设置背景空白（仅含培养基），以用于消除背景。 

4. 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。

5.在 -20°C 避光，可稳定保存12 个月。