细胞线粒体分离试剂盒简介

线粒体分离试剂盒能够使用差速离心从细胞中快速有效地分离线粒体。大多数分离的线粒体具有完整的内膜和外膜，以及生理功能。此外，该试剂盒还可用于提取线粒体蛋白和无线粒体的细胞质蛋白。该试剂盒包含足够的试剂，可用于 50-100×2 个细胞的 5-10*7 次分离程序。

细胞线粒体分离试剂盒使用方法

从 -20ºC 冰箱中取出各试剂，室温解冻，置于冰上备用。

2. 将 1.5 mL PMSF (solvent) 加入 PMSF (crystal) 中，充分溶解，即得 1.5 mL 100 mM PMSF 溶液。

3. 提前接种细胞，至细胞密度达到 70-90%。

4. 收集细胞贴壁细胞：弃去细胞培养液，加入 PBS 洗涤一次。加入 Trypsin Buffer 消化细胞，100-200 g，4ºC 离心 5-10 分钟。悬浮细胞：100-200 g，4ºC 离心 5-10 分钟收集细胞。注：Trypsin Buffer 本试剂盒未提供，需另行购买。

5. 加入预冷的 PBS 重悬细胞，600 g，4ºC 离心 5 分钟，弃去上清。

6. 每 2-5×10*7 个细胞中加入 1-2.5 mL Mitochondria Isolation Reagent(含 1 mM PMSF)，轻轻重悬细胞，冰浴 10-15 分钟。

7. 将细胞悬液转移至匀浆器中，匀浆 10-30 下。注：a. 需根据细胞类型及匀浆器类型自行优化匀浆次数。b. 可在匀浆 10 次后取 2 μL 细胞匀浆，加入 30-50 μL Trypan Blue 染色鉴定匀浆效果。若阳性细胞（蓝色）比例不足 80%，增加 5 次匀浆并用 Trypan Blue 染色鉴定，直至阳性比例超过 80%。c. 请勿过度匀浆，防止线粒体损伤。

8. 将细胞匀浆 600 g，4ºC 离心 10 分钟。

注：此步离心目的在于去除细胞核、细胞碎片及未裂解细胞。将离心速度提升至 1,000 g 可获得更纯的线粒体，但线粒体抽提率相对下降。

9. 将上清转移至干净的离心管，11,000 g，4ºC 离心 10 分钟。

注：此步离心目的在于沉淀线粒体。将离心速度改为 3,500 g 可获得更纯的线粒体，但线粒体抽提率相对下降。

10. 弃去上清，所得沉淀即为细胞线粒体。注：此步骤也可用于获得不含线粒体的细胞浆蛋白。收集本步骤中的上清，12,000 g，4ºC 离心 10 分钟，获得的上清液即为不含线粒体的细胞浆蛋白。后续可用 BCA 法或 Bradford 法测定蛋白浓度。

11. 线粒体的应用

a. 完整线粒体的功能及酶活研究：每 2-5×10*7 个细胞分离得到的线粒体中加入 150-200 μL Mitochondria Storage Buffer，重悬备用。后续可使用 线粒体膜电位检测试剂盒测定分离得到的线粒体的膜电位。

b. 线粒体蛋白分析：每 2-5×107 个细胞分离得到的线粒体中加入 150-200 μL 临用前添加了 PMSF 的 Mitochondria Lysis Buffer（PMSF 终浓度为 裂解后得到的线粒体蛋白经 12,000g，4ºC，离心 3-5 min 后可用于 PAGE、WB、IP 及酶活测定，也可用 BCA 法或 Bradford 法测定蛋白浓度。

注意事项及储存

1. 若要制备线粒体蛋白样品，需在 Mitochondria Isolation Reagent 和 Mitochondria Lysis Buffer 中加入 PMSF，且 PMSF 一定要在试剂加入样品前1-2 min 内加入，防止 PMSF 失效。

2. 整个实验在冰上或 4ºC 进行。所用溶液需冰浴或 4ºC 预冷。

3. 本实验获得的线粒体样品若不能及时使用，建议 -80ºC 保存。冻存后的线粒体不建议用于膜电位的检测

4.-20°C，避光保存1 年。