双荧光素酶试剂盒简介

荧光素酶双检测试剂盒含有高纯度 D-荧光素、腔肠嗪和专有反应缓冲液。首先将萤火虫荧光素酶工作溶液添加到样品中。该试剂含有D-荧光素，可产生萤火虫荧光素酶生物发光。接下来，将雷尼拉荧光素酶工作溶液添加到同一样品中。它淬灭萤火虫荧光素酶生物发光并产生雷尼拉荧光素酶生物发光。两种反应的光产生都可以在光度计上方便地测量。

双荧光素酶试剂盒使用方法

1. 材料准备

1.1 裂解缓冲液的制备（1×）

稀释裂解缓冲液 （5×） 1：5 与 dH2O（例如 1 mL 裂解缓冲液 + 4 mL dH2O)

1.2 萤火虫荧光素酶工作溶液的制备

简要离心萤火虫荧光素酶底物的离心管。通过将冻干的萤火虫荧光素酶底物重悬在 10 mL 萤火虫荧光素酶缓冲液中来制备萤火虫荧光素酶工作溶液。

1.3 雷尼拉荧光素酶工作溶液的制备

短暂离心雷尼拉荧光素酶底物（125×）。通过将 80 μL 雷尼拉荧光素酶底物 （125×） 添加到 10 mL 雷尼拉荧光素酶缓冲液中来制备雷尼拉荧光素酶工作溶液。通过将试管倒置几次来充分混合。

注意：萤火虫荧光素酶工作溶液和雷尼拉荧光素酶工作溶液可以分装成等分试样。避光并避免重复冻融循环时，试剂在-20°C下可稳定保存一个月，在-70°C下可稳定保存一年。

2. 细胞裂解

2.1 确定转染参数（铺板细胞密度和随后的孵育时间），以确保细胞在所需的裂解物制备时间汇合不超过95%。

2.2 小心地从细胞中取出培养基。用洗涤溶液（如PBS，不含奥瑟鲁姆的生理盐水培养基）洗涤细胞，以除去残留的培养基。

2.3 加入适量的裂解缓冲液（1×）。

注意：添加的裂解缓冲液（1×）的体积可以按比例调整。

2.4 加入适量的裂解缓冲液（1×）。每孔添加的裂解缓冲液（1×）的推荐体积如下：

2.5将培养板放在摇床上，在室温下轻轻摇动15分钟。

2.6裂解后，在12°C下以000，10rpm离心4分钟。 将上清液转移到新管中进行进一步分析。

3. 荧光素酶双重检测

3.1 将 20μL 细胞裂解物加入黑色平底 96 孔板中。

3.2 将 100 μL 萤火虫荧光素酶工作溶液加入每个含有细胞裂解物的孔中。

3.3 加入试剂后，立即读取样品以捕获萤火虫荧光素酶信号。

3.4 从步骤 100.3 向每个孔中加入 3 μL 雷尼拉荧光素酶工作溶液，然后立即再次读取样品以捕获雷尼拉荧光素酶信号。

3.5 计算萤火虫荧光素酶与雷尼拉荧光素酶的发光比值。

注意事项及储存

1. 发光强度以及衰减速率取决于荧光素酶的反应速率。温度对酶反应速率有直接影响，两种萤光素酶活性的合适温度约为室温 (20-25℃)，检测时请将样品与反应试剂平衡至室温。

5.在 -20°C 避光，可稳定保存12 个月。