天然氨基酸数量有限、结构保守，其构成的天然蛋白质已经无法满足蛋白质工程以及蛋白药物开发等领域的研究需求。

非天然氨基酸（non-natural amino acids, nnAAs）有结构多样的侧链基团，将其插入到蛋白质中可赋予蛋白质新的化学性质、结构及功能。非天然氨基酸插入为生物研究、生物治疗学及合成生物学提供了新的途径，在新兴领域中应用前景广阔：

（1）非天然蛋白质药物开发：nnAAs特殊的化学功能基团极大地拓展了蛋白质药物的设计空间，同时也为位点特异性偶联开辟了新途径，使抗体偶联药物具有良好的药代动力学、效价和抗原结合特性。

（2）酶进化：传统的酶或蛋白质工程依赖于用其余的19种天然氨基酸中的一种取代某一位点的某种氨基酸来改变酶或蛋白质的功能特性，而nnAAs的插入可以产生具有更高稳定性和改变催化性质的酶。

（3）非天然氨基酸探针：nnAAs作为高灵敏度的生物物理探针，可结合到重组蛋白质的特定位点，用于目标蛋白质的定量检测及结构和功能的精确分析。

（4）蛋白质材料：nnAAs插入可以产生新型蛋白质聚合物，以用于合成生物材料，例如合成生物粘合剂等。

与细胞蛋白表达相比，无细胞蛋白表达系统在非天然氨基酸插入领域具有天然优势：

（1）无细胞系统没有细胞膜阻碍，规避了nnAAs选择性问题；

（2）无细胞系统不受nnAAs可能产生的细胞毒性作用影响；

（3）有利于精细调控反应进程。

无细胞蛋白表达系统作为可灵活嵌入非天然氨基酸的强大技术台，避免了nnAAs的跨膜及胞内运输障碍、细胞生长毒性的问题，在研究蛋白质间相互作用、开发蛋白质药物、新型蛋白材料方面发挥着至关重要的作用。

珀罗汀生物对绿色荧光蛋白（GFP）进行非天然氨基酸定点插入，在CFPS体系中成功表达了含非天然氨基酸（pAcF/pAzF）的GFP，其中pAcF插入效率超过70%。pAzF插入效率低于pAcF，这可能是由于pAzF的叠氮基在生理条件下不稳定，导致pAzF被还原为对氨基苯丙氨酸（pAF）。