猪蛋白聚糖(PG) ELISA 试剂盒

实验原理

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，其基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过酶促反应放大信号，检测微量的蛋白质、细胞因子等生物活性物质。ELISA实验中所需的试剂和耗材需满足一定的质量要求，以保证实验结果的准确性和可靠性。

猪蛋白聚糖(PG) ELISA 试剂盒

产品包装：盒装

性状：瓶装液体

规格：96T/48T

保存条件：2-8℃

保存期限：6个月

运输条件：2-8℃低温运输，用干冰或者生物冰袋低温运输。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解 冻并确保样品均匀地充分解冻。

准备工作

1.孔板室温平衡1小时

2.做好布板图谱

3.样本解冻

4.准备各型号的移液枪、枪头、量筒

5.准备双蒸水

6.根据样本量配好样本希释液

7.根据样本量及洗板次数配好洗液

8.若需要提前设置好振板器、洗板器

9.准备足够量的擦手纸

10.根据说明书提示，溶解标准品

11.配制不同浓度的标准品

12.配制质控品

13.根据预实验结果稀释样本

14.准备好封板膜

操作步骤：

1. 加样：设置空白孔、标准孔和待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。每次实验都应制作标准曲线。如果样品浓度过高，可以用样品稀释液进行稀释，使样品符合试剂盒的检测范围。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物su标记抗体工作液 100μl（取1μl生物su标记抗体加99μl生物su标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

3. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物su标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

5. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 

注意事项

在进行ELISA检测时，需要注意以下几点：

1. 保证试剂盒的质量：选择质量可靠、经过认证的试剂盒，避免使用过期或质量不稳定的试剂。

2. 标准化操作：按照试剂盒说明书进行标准化操作，避免操作过程中的人为误差。

3. 避免交叉污染：在实验过程中，要特别注意防止样品和试剂之间的交叉污染，以免影响检测结果的准确性。

4. 温度控制：ELISA检测需要在恒温条件下进行，因此要确保实验过程中温度的稳定和准确性。

5. 空白吸光度值：在实验过程中，要特别注意空白吸光度值的稳定性，避免其对检测结果的影响。

6. 实验数据的处理：对实验数据进行正确的处理和分析，包括对异常值的处理、数据转换等，以确保结果的准确性和可靠性。

7. 质量控制：在实验过程中，应进行必要的质量控制，如定期进行室内质控和室间质评等，以确保实验室检测结果的准确性。

试剂盒会出现的问题及解决办法：

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶标记物。

解决办法：请按照操作步骤进行。

b.原因：试剂盒内容物未能充分回。

解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

c.原因：室温太低。

解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。

d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。

解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

e.原因：试剂盒已过有效期限。

解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。

a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。

解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

b.原因：操作时间拖太久。

解决办法：请在方法熟练后再进行操作。

c.原因：微孔间相互污染。

解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。

解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。

e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。

解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

a.原因：室温太高(>25℃)。

解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。

b.原因：底物溶液受到污染。

解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。

c.原因：反应时间超过太久。

解决办法：请控制反应时间。

d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。

解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。

解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。

解决办法：请参考2-f.

c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。

解决办法： 请参考2-d.

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