NADP苹果酸酶（NADP-ME）测试盒 

本品用于科研实验,不用于临床。

测定意义:
辅酶NAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的 NADH 经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成 ATP 的同时,形成大量的 ROS,同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。

需自备的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 3 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:

1 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2 组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。


充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

混匀,取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。

注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD+测定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 测定中△A(A2-A1)≤0.0222,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的计算:
(一) NAD+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 为△A,x 为 NAD+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD+(nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 为△A,x 为 NADH 浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

注 意: 检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

NADP苹果酸酶（NADP-ME）测试盒

生化试剂盒可以检测的样本类型有哪些?
  生化试剂盒的实验原理是基于化学反应,理论上是不受生物种属及样本类型的限制。生化试剂盒样本检测通常只分样本类型,不分种属。但是某些指标在不同种属或类型样本中的提取方式不同。因此,具体情况请参见说明书或与技术支持联系确认。

生化试剂盒样本检测的一般要求:
1)于生化检测而言,样本无溶血、脂血、的现象。组织样本需将血液洗净擦干后再进行称重处理。
2)样本处理后尽快进行检测,且保存于冰盒之上,待测。
求
3)样本需澄清,若不澄清,需离心后取上清进行检测(特殊指标除外)。
4)样本值应在试剂盒线性范围内,若超过线性范围,需稀释后再进行检测,若低于检测范围,需增加样本浓度后进行检测。

微量法和分光光度法的区别?
分光光度法:主流测定体系为1mL,测试仪器分光光度计,能够大限度地满足绝大多数用户的需要。
微量法:主流测定体系为0.2mL,测试仪器或分光光度计,测定更加简便快捷。

试剂盒规格中是100管和50管是什么意思?
(1)50管/48样:50管指能够做50次测定,48样指可以测试48个样品。如果每个样品重复测定3次,那么只能测定16个样品。其中有2次测定用于
空白管或者对照管。值得特别注意的是,50管/24样中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为8个(假设做3次重复)

(2)100管/96样:100管指能够做100次测定,96样指可以测定96个样品,如果每个样品重复测定3次,那么只能测定32个样品。其中有4次测定用
于空白管或者对照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理论测定次数少1~3次。其它规格的含义依次类推。值得特别注意的是,100
管/48样中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为16个(假设做3次重复)。

如何防止试剂盒失效?
    不要过早订购,以免试剂盒失效.收到试剂盒后,检查外包装是否正常。马上打开,按照试剂盒说明书核对试剂数量是否正确,注意瓶中试剂状态是否与说明书一致。如果有问题,或者怀疑,马上联系公司销售,进行确认。如果没有问题,请务必按照说明书进行试剂的保存。注意,不同试剂,可能需要分别保存在常温(25°℃)、4℃和-20℃,务必分别按照要求保存,不要整个试剂盒放置于冰箱。

如何进行预测定?
(1)务必在7个工作日内进行预测定,以确定该试剂盒是否适合您的样品,以免造成试剂盒和样品的浪费。
(2)选择2~3个预期差异比较大的样品,严格按照说明书进行操作,注意仪器工作状态,操作规范,控制好测定条件,尤其是温度。
(3)如实与公司销售沟通预测定结果,公司技术人员会确认测定结果是否正常,是否需要调整,如何进行调整,从而确保您的测定结果可靠。


比色皿有哪些规格?
(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法试剂盒都是选用1mL体系,只能用1mL比色皿,不可以用更大体积的比色皿,否则试剂量不够,无法正常比色。

(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法试剂盒都是选用0.25mL比色皿。一般客户都选择使用标仪(需要自备酶标板)

(3)紫外波长检测需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。

(4)不同规格的比色皿,其外观大小是一致的,都是1cm光径(也有0.5cm光径的比色皿,不常见,也可以用,但是计算时要注意修改计算公式),其内
容积差异在于壁的厚度。

代测的优点
(1)更加省事儿,不必为测定犯难。用户只要提供样品和想测定的指标,就不再需要为测定操心了,不再受到操作技能、仪器设备和时间
的限制,就等着拿到数据写论文。

(2)测定数据更有保障。严格的测定质量管理体系,从而保证了测定结果的真实可靠。我们还建立了定制度。

(3)防止样品损失无论是用户自己完成测定全过程,还是购买试剂盒完成测定,都可能因为缺乏测定经验,导致测定失败,从而损失样品的情况。对于生命科学研究而言,样品是最珍贵的。样品一旦损失,轻则造成研究进度被耽搁,重则造成研究失败!代测能够充分保证测定成功,从而防止了样品损失。当然,样品质量是测定成功的前提,而且样品质量只有用户自己才能控制和保证。

生化检测试剂盒的基本原理
  生化检测试剂盒,又称生化试剂盒,是利用特定的生物成分、动力学及化学反应等技术制备的试剂盒,用于检测生理学、病理学、药理学等领域中特定的生物分子或化学物质。生化检测试剂盒包括底物、酶试剂盒、探针等多个组成部分,其中的是底物-酶法。

底物-酶法是生化检测试剂盒检测的基本原理。在该过程中,底物与酶在细胞膜上结合形成基质酶,进而形成底物-酶复合物。随着时间的推
移,底物-酶复合物逐渐分解,释放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代谢,同时底物、酶和代谢产物都会对复合物的稳定性产生影响,从而影响检测试剂盒的检测结果。

生化试剂盒可以检测的样本类型有哪些?
   生化试剂盒的实验原理是基于化学反应,理论上是不受生物种属及样本类型的限制。生化试剂盒样本检测通常只分样本类型,不分种属。但是某些指标在不同种属或类型样本中的提取方式不同。因此,具体情况请参见说明书或与技术支持联系确认。

生化试剂盒样本检测的一般要求:
1)于生化检测而言,样本最-好无溶血、脂血、黄-疸的现象。组织样本需将血液洗净擦干后再进行称重处理。
2)样本处理后最-好尽快进行检测,且保存于冰盒之上,待测。
3)样本需澄清,若不澄清,需离心后取上清进行检测(特殊指标除外)。
4)样本值应在试剂盒线性范围内,若超过线性范围,需稀释后再进行检测,若低于检测范围,需增加样本浓度后进行检测。