DUMABIO/笃玛生物 品牌
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本品用于科研实验,不用于临床。
如何处理ELISA测定抗体疫苗的实验数据？
在ELISA试剂盒试验中我们总是碰到许多关于数据处理的难题，为了能我们更多更具体的了解在试验中数据处理的问题，下面一起来看看ELISA测定抗体之怎么处理试验数据。
ELISA做得很好的话批间CV都要有10～15％左右，用同一个抗原，但对于包被的抗原浓度对OD的影响不是很大，只要不是不同太大即可。抗血清当然要用同一个稀释度了。别的比较的话就必每批，每块板上的样品都要伴随着一个参比品一同做，参比品仍是同一个这样才干确保试验成果的可比性。
剖析：
（1）将同一只动物免疫不同时刻后抗体产生的效价进行比较。
（2）由上面能够得出一组数据，举个比如即如某个免疫间期抗体升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多数情况下可升高多少，即此种升高率的阳性率，然后再用泊松散布证明此阳性率是否赞同整体在这个免疫间期增高的阳性率，仍是由于随机误差的原因使试验得到了这个成果。
（3）计算出不同间期的效价水平后，能够用方差剖析进行整体比较，证明不同间期免疫的作用差异是否有计算学含义；然后再两两之间进行比较，看免疫作用*显着的是哪个间期。
ELISA试剂盒酶标板在什么情况下会失效？
ELISA试剂盒的保质期一般都是在一年，如果保存妥当的话，不会出现问题的。但不要重复冻融。当然如果是正常的DAS-ELISA检测试剂盒等，应该放在4℃左右冰箱保存。主张ELISA试剂盒冻结后一次用完。已开封或许运用后，剩下试剂仍需依照试剂瓶标签所示的温度保存，ELISA检测试剂盒开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20℃，防止湿润。
但要留意的是，如果将ELISA试剂盒刚从冰箱里边拿出来就当即运用的话，可能会影响，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
主张：先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在ELISA检测试剂盒运用前与室温平衡。这样做的意图，首要是为了在后面的温育反响过程中，能使反响微孔内的温度能较快地到达所要求的高度，以满意测定要求。
试剂盒规格中是100管和50管是什么意思?
(1)50管/48样:50管指能够做50次测定,48样指可以测试48个样品。如果每个样品重复测定3次,那么只能测定16个样品。其中有2次测定用于
空白管或者对照管。值得特别注意的是,50管/24样中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为8个(假设做3次重复)
(2)100管/96样:100管指能够做100次测定,96样指可以测定96个样品,如果每个样品重复测定3次,那么只能测定32个样品。其中有4次测定用
于空白管或者对照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理论测定次数少1~3次。其它规格的含义依次类推。值得特别注意的是,100
管/48样中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为16个(假设做3次重复)。
如何防止试剂盒失效?
不要过早订购,以免试剂盒失效.收到试剂盒后,检查外包装是否正常。马上打开,按照试剂盒说明书核对试剂数量是否正确,注意瓶中试剂状态是否与说明书一致。如果有问题,或者怀疑,马上联系公司销售,进行确认。如果没有问题,请务必按照说明书进行试剂的保存。注意,不同试剂,可能需要分别保存在常温(25°℃)、4℃和-20℃,务必分别按照要求保存,不要整个试剂盒放置于冰箱。
如何进行预测定?
(1)务必在7个工作日内进行预测定,以确定该试剂盒是否适合您的样品,以免造成试剂盒和样品的浪费。
(2)选择2~3个预期差异比较大的样品,严格按照说明书进行操作,注意仪器工作状态,操作规范,控制好测定条件,尤其是温度。
(3)如实与公司销售沟通预测定结果,公司技术人员会确认测定结果是否正常,是否需要调整,如何进行调整,从而确保您的测定结果可靠。
荧 光 分 析 法
荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，各种络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。
比色皿有哪些规格?
(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法试剂盒都是选用1mL体系,只能用1mL比色皿,不可以用更大体积的比色皿,否则试剂量不够,无法正常比色。
(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法试剂盒都是选用0.25mL比色皿。一般客户都选择使用标仪(需要自备酶标板)
(3)紫外波长检测需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。
(4)不同规格的比色皿,其外观大小是一致的,都是1cm光径(也有0.5cm光径的比色皿,不常见,也可以用,但是计算时要注意修改计算公式),其内
容积差异在于壁的厚度。
代测的优点
(1)更加省事儿,不必为测定犯难。用户只要提供样品和想测定的指标,就不再需要为测定操心了,不再受到操作技能、仪器设备和时间
的限制,就等着拿到数据写论文。
(2)测定数据更有保障。严格的测定质量管理体系,从而保证了测定结果的真实可靠。我们还建立了定制度。
(3)防止样品损失无论是用户自己完成测定全过程,还是购买试剂盒完成测定,都可能因为缺乏测定经验,导致测定失败,从而损失样品的情况。对于生命科学研究而言,样品是最珍贵的。样品一旦损失,轻则造成研究进度被耽搁,重则造成研究失败!代测能够充分保证测定成功,从而防止了样品损失。当然,样品质量是测定成功的前提,而且样品质量只有用户自己才能控制和保证。
生化检测试剂盒的基本原理
生化检测试剂盒,又称生化试剂盒,是利用特定的生物成分、动力学及化学反应等技术制备的试剂盒,用于检测生理学、病理学、药理学等领域中特定的生物分子或化学物质。生化检测试剂盒包括底物、酶试剂盒、探针等多个组成部分,其中的是底物-酶法。
底物-酶法是生化检测试剂盒检测的基本原理。在该过程中,底物与酶在细胞膜上结合形成基质酶,进而形成底物-酶复合物。随着时间的推
移,底物-酶复合物逐渐分解,释放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代谢,同时底物、酶和代谢产物都会对复合物的稳定性产生影响,从而影响检测试剂盒的检测结果。
生化试剂盒可以检测的样本类型有哪些?
生化试剂盒的实验原理是基于化学反应,理论上是不受生物种属及样本类型的限制。生化试剂盒样本检测通常只分样本类型,不分种属。但是某些指标在不同种属或类型样本中的提取方式不同。因此,具体情况请参见说明书或与技术支持联系确认。
生化试剂盒样本检测的一般要求:
1)于生化检测而言,样本最-好无溶血、脂血、黄-疸的现象。组织样本需将血液洗净擦干后再进行称重处理。
2)样本处理后最-好尽快进行检测,且保存于冰盒之上,待测。
3)样本需澄清,若不澄清,需离心后取上清进行检测(特殊指标除外)。
4)样本值应在试剂盒线性范围内,若超过线性范围,需稀释后再进行检测,若低于检测范围,需增加样本浓度后进行检测。
微 量 分 析 法
培养基的防霉以及霉后的处理方法
防霉办法
1、培育果蝇的器皿要严格消毒。培育瓶洗洁净后，自然凉干，再与棉塞一道进行高温枯燥灭菌(120℃，30min) 。
2、养分要全面。种类许多，本实验室用的是玉米培育基。
配方：
水750mL煮开，加琼脂6.2g，待琼脂溶解后加白糖62.5g，拌和溶解后加调成糊状的玉米糊，煮开2～3min，加酵母粉7g，加热1～2min，拌和均匀后，移去火源，加丙酸2mL。培育基稍稍冷却后，倒入已灭菌的瓶中，尽量不要粘在瓶壁上，塞好棉塞，放入仍有余热的枯燥箱中将瓶壁上的水蒸干。
3、接种时消好毒。在无菌室内接种，如没有无菌室，在接种前用75%酒精棉球擦双手一遍。接种后，放入适宜果蝇成长温度的培育箱中培育果蝇(温度20～25℃)，一旦下一代成蝇孵出来后，这样就就不易长霉啦。
培育基的霉后处理办法
由于霉菌孢子漂浮于培育瓶的整个空间，包括果蝇身上，如将此果蝇接种到新的里边，大约经过4 ～5d，培育基将会重新长出霉菌来。遇到该问题，解决的办法只要两种：① 不再接种这种长霉菌果蝇，重新接种未长霉的果蝇；② 采取办法杀死果蝇身上的霉菌孢子。
杀霉菌办法：
将带有霉菌孢子的成蝇倒入空培育瓶中，棉塞上倒适量的75%酒精，再将瓶口塞紧，使用酒精具有蒸发性，蒸发后的酒精充满整个瓶内，从而将果蝇身上的霉孢子杀死。
上海酶联生物提醒注意：
1、倒在棉塞上的酒精量要适宜，过多果蝇易醉昏，过少杀死不了霉菌孢子；
2、果蝇呆在空瓶内的时间要恰当，以2d为好。
脲酶（UE）测试盒
本品用于科研实验,不用于临床。
测定意义:
辅酶NAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的 NADH 经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成 ATP 的同时,形成大量的 ROS,同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。
需自备的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 3 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。
NAD+和 NADH 的提取:
1 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:
混匀,取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。
注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD+测定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 测定中△A(A2-A1)≤0.0222,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.
NAD+和 NADH 含量的计算:
(一) NAD+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 为△A,x 为 NAD+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD+(nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)
(二)NADH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 为△A,x 为 NADH 浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注 意: 检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
