AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

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美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助quan世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

 AAT Bioquest qing化物5.5马来酰亚胺

AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]，产品简介：

产品品牌：AAT Bioquest

产品货号：175

产品名称：qing化物5.5马来酰亚胺[相当于Cy5.5®马来酰亚胺]

英文名称：AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

产品规格：1 mg

产品说明：

多种花青 5.5 （Cy5.5®） 染料已被用于标记生物分子，用于荧光成像和其他基于荧光的生化分析。它们广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等。Cy5.5®染料是最常见的红色荧光团之一。Cy5.5®马来酰亚胺容易与硫醇基团反应。Cy5.5®是GE Healthcare的商标。

示例协议

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1.花青5.5马来酰亚胺储备液（溶液B）

将无水DMSO加入花青5.5马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。注意：在开始偶联之前制备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情况下可在冰箱中储存长达 4 周。避免冻融循环。

2.蛋白质储备液（溶液A）

将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白标记储备液。注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白质稳定的抗体将不能很好地标记。注意：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白浓度范围为 2-10 mg/mL。

3. 可选

如果您的蛋白质不含游离半胱an酸，则必须用 DTT 或 TCEP 处理您的蛋白质以生成硫醇基团。DTT 或 TCEP 用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1. 在蒸馏水中制备1M DTT（15.4mg / 100μL）的新鲜溶液。

2. 在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液中加入 20 μL DTT 原液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸）。

3. 将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预先平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。

4. 确定蛋白质浓度并将馏分与大部分 IgG 合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。

5. 在此步骤之后尽快进行偶联（参见样品实验方案）。注意：IgG 溶液应为 >4 mg/mL，以获得最佳效果。如果抗体低于 2 mg/mL，则应浓缩抗体。在缓冲液交换柱上额外增加 10% 的损失。注意：还原可以在pH 7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。注意：步骤 3 和 4 可以用透析代替。

实验方案样本

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与花青 5.5 马来酰亚胺的偶联物而开发的。您可能需要针对您的特定蛋白质进行进一步优化。注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而染料/蛋白质比率低的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

运行偶联反应

以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1的摩尔比作为起点：将5μL染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10mM）加入蛋白质溶液（95μL溶液A）的小瓶中，有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。 注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比为 10：1。如果太少或太高，则分别确定 5：1、15：1 和 20：1 的最佳染料/蛋白质比例。

在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联物

以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱进行染料-蛋白偶联纯化的示例。

根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。

将反应混合物（来自“运行共轭反应”）加载到 Sephadex G-25 色谱柱的顶部。

一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即加入 PBS （pH 7.2-7.4）。

向所需样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的馏分。注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分用于多种用途。注意：为了长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

  AAT Bioquest qing化物5.5马来酰亚胺

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