RT-qPCR用 Maxima链cDNA合成试剂盒

RT-qPCR 用 Thermo Scientific Maxima 链 cDNA 合成试剂盒是一种针对两步法定量 RT-PCR (RT-qPCR) 应用中的 cDNA 合成进行优化的便捷系统。该试剂盒采用 Maxima 逆转录酶 (RT)，这是 M-MuLV RT 经体外进化而得到的一种高级酶。与野生型 M-MuLV RT 相比，该酶具有较高的热稳定性和耐受性且 cDNA 合成速率提高。

RT-qPCR 用 Maxima 链 cDNA 合成试剂盒能够在较高温度（42 至 65°C）下从较宽范围的 RNA 总量（1 pg 至 5 µg）进行可重现的 cDNA 合成。合成反应可在15至30分钟内完成。RT-qPCR 用 Maxima 链 cDNA 合成试剂盒组分已预混合，因而可节省时间并减少可能出现的移液错误。

Features

 

• 以宽范围(0.01 pg – 5 μg)的起始RNA量可重复性地合成cDNA 。
• 提高了合成效率 – 15分钟内完成cDNA合成。
• 提高了反应温度 – 可高达60°C。
• 方便的设计 – 预混合溶液以方便在RT-qPCR 中的应用。

Applications

 

• 两步 RT-qPCR。

说明

Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit是一个适用于两步实时定量PCR(RT-qPCR)的优化了cDNA合成的方便体系。该试剂盒采用了Maxima® Reverse Transcriptase，这是一个从M-MuLV RT进化衍生出的高效逆转录酶。该酶具有高热稳定性，耐用性及提高的的合成率。Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit能以宽范围(1 pg to 5 µg)的初始RNA量在提高的温度下(50-60°C)可重复性地合成cDNA。合成反应能在15-30分钟内完成。

Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit的组分对于RT-qPCR的使用者来说非常方便。试剂盒的成分是预混合好的以节省时间和降低可能的移液错误。试剂盒组分包括Maxima® Enzyme Mix, 5X Reaction Mix, 水（不含核酸酶)。

Maxima® Enzyme Mix 包含Maxima®逆转录酶和RiboLock™核糖核酸酶抑制剂。重组的RiboLock™抑制剂有效地保护RNA模板在温度高至55°C的范围内不被RNases A、B 和 C降解。

5X Reaction Mix 包含了余下的反应组分：反应缓冲液，dNTPs, oligo (dT)₁₈ 和随机引物六聚体。

Water, nuclease-free 适用于反应体系的搭建和样品RNA 的稀释。它已经通过测试不含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。

 

质量控制

已在在两步RT-qPCR中进行了功能测试，即以不同起始量(5 ng-0.5 fg)的 RNA为转录物逆转录反应及随后的采用Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix的扩增反应。效率在90-110%的范围内，斜率在-3.09 和 -3.58之间，相关系数>0.99。

 

组分

• Maxima® Enzyme Mix
• 5X Reaction Mix
• Water, nuclease-free
• 详细的使用说明

图1。高灵敏度两步RT-qPCR。
A – 扩增图。
B – 标准曲线。
基于Jurkat 细胞不同量的总RNA (5 μg, 2.5 μg, 1 μg, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg)的人PPP1CA 基因的扩增。通过Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (#K1641)合成链cDNA。采用针对PPP1CA的TaqMan® 分析和Maxima® Probe /ROX qPCR Master Mix (2X) 扩增链cDNA。反应在ABI 7500 Real-Time PCR 仪器上操作进行。1 pg 的总RNA被成功检测出。反应效率是105%，斜率为3.29，R² =0.999。

图2。采用Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR得到的可重复性的RT-qPCR 结果. 。
链的cDNA由100 ng-1 pg 的 Jurkat细胞总RNA 和Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit和从16个复制反应中合成得到。合成出的cDNA在随后的在ABI 7500 实时PCR仪上进行的qPCR 反应作为模板应用。平行的逆转录酶反应显示出以宽范围RNA 起始量合成cDNA的可重复性和低变化性(<1% SD/Cq)。

图3。Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR的高产量和高灵敏度。
E.coli 23SRNA基因的扩增基于10倍梯度稀释的总RNA (30 ng to 3 fg)。链的cDNA 的产生采用了Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR（红色） 以及来自其他供应商逆转录试剂盒（蓝色）。cDNA的扩增采用Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (#K0221/2/3)在ABI 7500 实时PCR仪上进行。在采用了Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit的反应，全部的起始RNA量(30 ng – 3 fg) 以较低的Cq 和102% 的反应效率成功地检测出。对照试剂盒没有检测出的3 fg 稀释度的RNA且qPCR产物的产率也相对较低。