如何用间充质干细胞无血清培养基培养间充质干细胞

如何用间充质干细胞无血清培养基培养间充质干细胞
 

间充质干细胞无血清培养基，货号NC0103，英文名称：Mesenchymal Stem Cell Serum-free Medium。

【间充质干细胞无血清培养基   用途与描述】
间充质干细胞无血清培养基可用于多种来源的人类间充质干细胞的原代细胞分离及细胞传代，同时还能保持其多向分化的潜能，如骨髓（BM-hMSC)、脂肪组织（AT-hMSC）、脐带（UCM-hMSC）。使用本产品无需添加血清或血清替代物。
间充质干细胞无血清培养基化学成分明确、无血清、无动物源成分。产品批间差异小，所有原料符合GMP标准。更适合临床研究用途。

【间充质干细胞无血清培养基   规格与保存】

* 胰蛋白酶抑制剂，并不用于间充质干细胞的培养。仅单独用于细胞消化时终止细胞消化进程。
由于间充质干细胞无血清培养基中没有添加胰酶抑制剂，因此不可用间充质干细胞无血清培养基终止细胞消化。仅可用胰蛋白酶抑制剂终止细胞消化。

【间充质干细胞无血清培养基   使用方法】

1. 间充质干细胞*培养基准备

将间充质干细胞无血清培养基添加剂在2-8℃过夜融化，按1:100比例加入培养基基础中即成为间充质干细胞*培养基。

特别提醒：间充质干细胞*培养基2-8℃避光可保存30天。
科研用途小量、多次使用，建议采用分装培养基添加剂后以-20℃保存的形式，可避免培养基的浪费。

2. 间充质干细胞复苏（以T-75瓶为例）

1)从冰箱中取出*培养基，在生物安全柜或超净台中吸取适量（如T-75瓶：10-15mL)*培养基沿上表面加入间充质干细胞培养瓶中，
切勿冲到培养瓶底面（细胞生长面）。然后慢慢将培养瓶放平，在生物安全柜或超净台中室温放置5-10分钟后使用。

特别提醒：请严格按照此步骤操作，否则可能会出现培养瓶中细胞生长空白区域，即所谓的“生长空洞”。原因是多数用户使用的不是
的预包被培养瓶，而是普通的培养瓶或培养皿，其表面并不适合无血清培养环境下的MSC的贴壁。室温放置10分钟，可让培养基
中的促贴壁物质更好的结合在培养瓶底部，MSC细胞的贴壁能力更强，不会出现“生长空洞”。

2) 从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴快速融解。

3) 在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入5-10 mL 预温的*培养基中。

4) 1000 rpm 离心3 min，弃上清，加入2 mL*培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，按密度2x10⁴ cells/cm² 将细胞接种至1)步骤中
孵育完的培养瓶中，添加时，将培养瓶立起来，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到培养瓶底面。

5) 混匀后，将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养，培养条件37℃，5%CO2 。 

6) 24 h后，更换新鲜的、预温的*培养基。 

3. 间充质干细胞传代培养（以T-75瓶为例）

1) 在显微镜下观察间充质干细胞 ，当间充质干细胞融合度达到90%，即可传代。

特别提醒：细胞融合度请勿超过90%。很多传代后的细胞大比例死亡，是由于传代前细胞生长过密（融合度过高），导致细胞消化异常
（细胞整片或成片脱落），加之随后的不当操作（如用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞），此机械损失过程会严重损害细胞
膜，引发大比例的细胞死亡，特别是MSC细胞经冻存后再次使用时。

2) 预处理培养瓶，处理方法同细胞复苏中的1)步骤。

3) 在超净台中，弃去培养瓶中的培养液，加入5-10 mL PBS清洗细胞后弃去（此步可选，目的是去除变圆脱落的死细胞），再加入2 mL
 0.05%胰酶-EDTA 或无动物源基因重组胰酶（货号NC1002）消化细胞。

4) 在显微镜下观察到细胞变圆时，立即加入5 mL 胰酶抑制剂（配套产品，货号NC1003）终止消化。

5) 用移液器轻轻吹打瓶壁上未*脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞*分散。

6) 将细胞悬液转移到15 mL 离心管中，1000 rpm离心3 min。弃上清，加入2 mL*培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，按细胞密度
2x10⁴cells/cm² ，将细胞接种至细胞传代 2)步骤中孵育完的培养瓶中，添加时，将培养瓶立起来，直接加到底部，切忌冲到培养瓶底面。

7) 将培养瓶置于37℃，5%CO₂ 条件下培养。 

4. 间充质干细胞冻存

1) 用0.05%胰酶消化待冻存的间充质干细胞，加入胰酶抑制剂（货号NC1003）终止消化并离心，重悬后进行细胞计数。

2) 1000 prm 离心3 min，去除上清。

3) 根据计数情况，缓慢加入适量冷的无血清冻存液（无血清冻存液可即拿即用或置于冰袋备用），调整细胞密度在1x10⁶ cells/mL左右。

4) 轻轻地重悬细胞，将重悬均匀的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记）中，旋紧冻存管盖 。

5) 迅速将冻存管放入程序降温盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃冰箱。
注：如果使用Yocon无血清细胞冻存液(货号 NC1001），则不需要程序降温步骤，可直接将细胞放于-80℃冰箱。

6) 12 h后将细胞从-80℃冰箱转移至液氮中长期保存。
 

友康生物第3代间充质干细胞无血清培养基面向的目标群体是从事干细胞存储、干细胞临床应用及干细胞研发领域的专业用户。该产品创新性的特点是：用2代的价格向市场提供了3代的间充质干细胞无血清培养基产品。