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ELISA 注意事项

1) 确保所有的试剂在使用前已经达到室温（除非指明要保持低温的）。

2) 如果你不打算用完整块平板，确保剩余的8联管放回有干燥剂的平板袋中并密封，以防受潮使产品效果下降。

3) 对于不是一次性使用的标准品，把剩余的标准品小量分装并冻存。这使标准品免于反复冻融。

4) 多通道移液枪可使你的标准品和样品加样能力加快，并取得一致性更高的结果。

5) 移液操作进行放液时枪头与垂直方向偏离一点角度，不要触碰样品孔底部。

6) 复孔样品加样时不需要换枪头；为避免样品污染，取不同样品或标准品时要换枪头。

7) 如有可能尽量使用洗板机，不熟练的手工洗板可能导致高背景。

8) 在洗板时，无论是手工还是用洗板机，在两次洗涤中增加30秒的浸润时间，以确保洗涤的效果。

9) 注意孵育时间，通用的建议是每小时的孵育时间的误差要控制在+/-5分钟以内。

10) 如果实验要求在2-8度的低温孵育，而且你同时进行多块板的操作，不要把平板互相叠放，要并排分别放置。

抗原和抗体*工作浓度的确定

抗原抗体反应要求在zui适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行*工作浓度的滴定和选择，以达到*的测定条件。

方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。

方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的*、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的*、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为zui适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的*工作浓度。

抗体的稀释度及稀释液的测定方法

抗体的稀释度包括特异性抗体，中间抗体及标记抗体。任何一种免疫组化方法要想得到令人满意的染色效果，必须将抗体进行*稀释。一般来说，抗体的稀释度取决于下列因素。

(一)抗体的浓度(亦称滴度)

每毫升溶液内所含抗体分子越多，滴度就越高，该抗体可高度稀释，尤其是特异性一抗的稀释度。一般商品化抗体只知道每毫升含多少抗体蛋白量，不知道所含抗体分子。自己制备抗体可通过琼脂糖双扩散或放射免疫法进行测定。商品化抗体一般告知大约的稀释度，例如用PAP法可1：100～1：200稀释。但往往购买到一种新抗体后，需要利用组织切片进行*稀释度的测定。

(二)稀释度的测定方法

在测定抗体*稀释度时，可将阳性强度与背景染色以“+”形式来表达，“+ + + +”为*阳性，“+ + +”为强阳性，“+ +”为弱强阳性，“+”为弱阳性，“一”为阴性。

1．直接测定法

按表2—4稀释抗体，4℃过夜，观察分析结果。从表2—4的结果中可知，400为*稀释度，因其特异性染色强，且背景低。

表2-4 抗体稀释度的直接测定法

一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性 一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性

l： 50 + + + + + + l：400 + + + (一)

1：100 + + + + + + 1：500 + + (一)

1：200 + + + + + 阴性对照 (一) (一)

1：300 + + +

2．棋盘稀释测定法

按表2—5稀释、测定，从表中显示的结果可知，一抗1：100、二抗1：200为*稀释度。

表2-5 抗体稀释度的棋盘稀释测定法

第二抗体 一抗稀释度

1 ： 50 l：100 1：200 1：400

1：100 + + + +(+ +) + + + +(+ +) + + +(一) +(一)

1：200 + + + +(土) +++(一) + +(一) +(一)

1：400 + +(一) +(一) (一) (一)

注：括号内为背景染色

(三)抗体的配制

抗体的配制及使用是开展免疫组织化学工作的一个重要环节，其检测的结果既要可靠，又要能重复，这就要求实验人员在配制抗体过程中要注意其度。目前，随着抗体稀释液的稳定性提高，一次稀释抗体可用一年。当然，还可以购买到商品化即用型一抗，使用非常方便。

(四)抗体稀释液的种类

可根据需要选择不同的抗体稀释液。如稀释当天用完的一抗，用0．05m01／L(pH7.6)TBS即可。如需长期保存，可用如下稀释液：取0．1g明胶(或绿色明胶)溶在100ml0.05m01／L(pH7．6)TBS缓冲液中，边搅拌边加热至60℃，待*溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清白蛋白，zui后加入200mg aN3，分装保存在一40℃中备用。另外，抗体原液应分装后一40℃保存，可保存5年以上。